Bakteriers struktur och klassificering

Bakterier klassificeras preliminärt efter cellhöljets uppbyggnad, färgningsegenskaper, form, arrangemang och specialstrukturer, men säker artbestämning kräver vanligen kompletterande fenotypiska eller molekylära metoder. Strukturen avgör samtidigt centrala kliniska egenskaper som virulens, immunaktivering, antibiotikakänslighet och överlevnad i miljön.

Bakteriecellen: grundorganisation och klassifikationsprinciper

Bakterier är prokaryota, vanligen encelliga organismer. Det genetiska materialet ligger i en nukleoid utan membranomsluten kärna, och cytoplasman saknar i regel eukaryota membranorganeller. Trots detta är bakteriecellen starkt organiserad: kromosomreplikation, transkription, translation, energiomsättning, transport och cellväggssyntes är rumsligt och tidsmässigt samordnade. Ribosomer, cytoskelettproteiner, membrandomäner och ibland specialiserade intracellulära membran eller proteinbaserade mikrokompartment skapar funktionell kompartmentalisering.

Strukturell klassifikation beskriver observerbara egenskaper såsom gramreaktion, syrafasthet, cellform, delningsmönster, sporbildning, kapsel och motilitet. Dessa egenskaper är omedelbart kliniskt användbara. Grampositiva kocker i klasar i ett blododlingsprov leder exempelvis till andra preliminära överväganden än gramnegativa stavar, och förekomst av syrafasta stavar kräver annan provhantering och diagnostik än rutinmässig bakterieodling. Morfologi är dock en fenotyp och behöver inte motsvara genetiskt släktskap.

Modern taxonomi bygger i stället på evolutionära relationer. Sekvensering av 16S-rRNA-genen används för bred fylogenetisk placering, särskilt när odling eller rutinidentifiering misslyckas. Helgenomsekvensering och jämförelse av genomsnittlig nukleotididentitet, ANI, ger högre upplösning mellan närstående taxa och kan samtidigt kartlägga resistens-, virulens- och utbrottsmarkörer. Kolonimorfologi, färgning, enzymtester och motilitet ger därför en preliminär diagnostisk profil, men räcker sällan ensamma för säker artbestämning.

Storlek, form och yt–volymförhållande

Flertalet bakterier är omkring 0,2–2,0 µm breda och högst cirka 10 µm långa. En typisk Escherichia coli-cell är ungefär 0,5 × 2 µm. Kocker är ofta 0,5–1,0 µm i diameter, medan stavar vanligen är 0,5–1,0 µm breda och 1–10 µm långa. Bakterier nära 0,2 µm ligger vid ljusmikroskopets praktiska upplösningsgräns och kan vara svåra att se även efter färgning.

Den lilla cellstorleken ger ett stort yt–volymförhållande. Membranytan, där näringsupptag, avfallsutsöndring, elektrontransport och jonflöden sker, blir därmed stor i förhållande till den metaboliskt aktiva cytoplasmavolymen. Korta diffusionsavstånd möjliggör snabb fördelning av metaboliter och bidrar till att många bakterier kan växa fort när substrat, temperatur och andra förhållanden är gynnsamma. När cellradien ökar växer volymen snabbare än ytan, vilket kan göra membrantransport och intracellulär diffusion hastighetsbegränsande.

Storleksvariationen är ändå mycket stor. Cellväggslösa Mycoplasma är omkring 0,2–0,4 µm, medan den filamentösa svavelbakterien Thiomargarita magnifica kan bli upp till cirka 2 cm och därmed ses utan mikroskop. Stora bakterier kompenserar ofta för ogynnsamt yt–volymförhållande genom särskild intern organisation, stor vakuolliknande volym eller lagring av näringsämnen. Storlek måste därför tolkas tillsammans med cellstruktur och livsmiljö.

Cellform, delningsplan och mikroskopiskt arrangemang

Cellformen bestäms främst av var nytt peptidoglykan infogas. MreB, en funktionell motsvarighet till aktin, organiserar lateral cellväggssyntes i många stavformade bakterier. FtsZ, en tubulinliknande GTPas, bildar en dynamisk Z-ring vid det framtida septumet och rekryterar det maskineri som syntetiserar skiljeväggen. Crescentin bildar intermediärfilamentliknande strukturer längs den konkava sidan hos vissa krökta bakterier och begränsar där expansionen, så att cellen böjs.

Kockers arrangemang avspeglar delningsplan och graden av separation mellan dottercellerna. Delning i ett plan ger diplokocker eller kedjor; Neisseria uppträder typiskt som diplokocker och Streptococcus som kedjor. Delning i flera plan ger oregelbundna, druvklaseliknande aggregat hos Staphylococcus. Två vinkelräta delningsplan kan ge tetrader, medan tre ortogonala plan ger kubiska sarcina-paket om 8, 16 eller fler celler. Stavar kan bilda kedjor, och Corynebacterium kan efter snäppande celldelning ligga i palissader eller V- och Y-formade arrangemang.

Morfologin är inte oföränderlig. Näringsbrist, cellålder, osmotisk stress och skador på cellväggssyntesen kan ge svullna, avlånga eller oregelbundna celler. Betalaktamer kan orsaka filamentering när septationen hämmas utan att längdtillväxten omedelbart upphör. Partiell cellväggsförlust ger sfäroplaster, och cellväggslösa bakterier är naturligt pleomorfa. Upphettning, uttorkning och mekanisk påverkan under prepareringen kan dessutom deformera cellerna; ett avvikande mikroskopifynd bör därför verifieras i ett välbevarat prov.

Peptidoglykan: uppbyggnad, syntes och mekanisk funktion

Peptidoglykan, eller murein, är ett sammanhängande nätverk runt cytoplasmamembranet. Glykansträngarna består av alternerande N-acetylglukosamin, NAG, och N-acetylmuraminsyra, NAM, förenade med β-1,4-glykosidbindningar. Till NAM sitter korta peptidstammar med bland annat L-alanin, D-glutamat, D-alanin och antingen L-lysin eller diaminopimelinsyra. Tvärbindning mellan peptidstammarna kopplar samman glykansträngarna till en mekaniskt stark säck.

Syntesen börjar i cytoplasman med UDP-bundna sockerprekursorer. Mur-enzymer bildar UDP-NAM-pentapeptid, som överförs till lipidbäraren undekaprenylfosfat i membranet och bildar lipid I. Tillsats av NAG ger lipid II. Prekursorn transporteras till membranets utsida, där transglykosylaser förlänger glykansträngarna. Penicillinbindande proteiner, PBP, utför därefter transpeptidering; terminalt D-alanin avspjälkas och energin används för tvärbindningen. Samtidig, noggrant reglerad autolys öppnar det befintliga nätverket så att nytt material kan infogas.

Nätverket motstår cellens osmotiska turgor, som hos grampositiva bakterier kan närma sig 20 atm. Om väggen bryts ned i hypoton miljö expanderar membranet och cellen kan lysera. Fullständig väggförlust hos en grampositiv bakterie ger en protoplast, medan partiell väggförlust, särskilt hos gramnegativa bakterier där det yttre membranet kvarstår, ger en sfäroplast. Sådana former kan överleva i osmotiskt skyddande medier men är mekaniskt instabila.

Grampositivt cellhölje

Grampositiva bakterier har ett enda cytoplasmamembran och saknar yttre membran. Utanför membranet ligger ett multilagrigt peptidoglykan, vanligen 20–100 nm tjockt, som kan motsvara omkring 20–40 procent av cellens torrvikt. Det tjocka lagret är poröst för många små molekyler men ger hög draghållfasthet och utgör en plattform för cellväggsenzymer, adhesiner och andra ytproteiner.

Väggteikonsyror är fosfatrika polymerer som är kovalent bundna till peptidoglykanet. Lipoteikonsyror är i stället förankrade med en lipid i cytoplasmamembranet och sträcker sig genom väggen. Fosfatgrupperna bidrar till negativ ytladdning, katjonbindning, autolysinreglering och cellhöljets organisation. D-alanylering minskar nettoladdningens negativa karaktär och därmed bindningen av katjoniska antimikrobiella peptider; detta kan öka motståndskraften mot medfödda immunförsvarsmekanismer.

Sortasenzym kan kovalent fästa adhesiner och andra ytproteiner i peptidoglykanet. Sådana proteiner är centrala för kolonisation, biofilm och vävnadsbindning hos bland annat Staphylococcus och Streptococcus. Kliniskt viktiga grampositiva grupper omfattar även Enterococcus samt sporbildande Bacillus- och Clostridium-relaterade bakterier. Gramreaktionen är dock inte en säker fylogenetisk markör: Deinococcus kan färgas grampositivt trots ett hölje med gramnegativt-liknande strukturella drag.

Gramnegativt cellhölje och lipopolysackarid

Det gramnegativa höljet består av cytoplasmamembran, periplasma och yttre membran. Periplasman är ungefär 5–20 nm bred och innehåller ett cirka 2–10 nm tunt peptidoglykanlager samt enzymer, chaperoner och substratbindande proteiner. Peptidoglykanet ger formen men svarar för en betydligt mindre del av höljet än hos grampositiva bakterier. Braun-lipoprotein kan binda det yttre membranet till peptidoglykanet och stabilisera hela strukturen.

Det yttre membranet är asymmetriskt: det inre lagret består huvudsakligen av fosfolipider, medan det yttre domineras av lipopolysackarid, LPS. LPS består av tre regioner. Lipid A förankrar molekylen i membranet, kärnpolysackariden sammanbinder delarna och O-antigenet bildar en utåtriktad, variabel polysackaridkedja. O-antigenets variation används vid serotypning. Lipid A aktiverar det medfödda immunsystemet och kan vid omfattande exponering utlösa kraftig cytokinsignalering, vasodilatation, kapillärläckage, koagulationsaktivering och septisk chock.

Poriner bildar vattenfyllda kanaler för passiv diffusion av små hydrofila ämnen, med en ungefärlig storleksgräns kring 600 Da för generella poriner. Större eller hydrofoba molekyler passerar sämre. Det yttre membranet begränsar därför inträde av flera antibiotika, detergenter och gallsalter. Förlust eller förändring av poriner kan minska antibiotikaupptaget, medan periplasmatiska betalaktamaser kan hydrolysera betalaktamer innan dessa når sina PBP-mål.

Gramfärgning: steg, mekanism och tolkning

Gramfärgning utförs på ett tunt utstryk som lufttorkas och fixeras. Preparatet färgas först med kristallviolett. Jod tillsätts som mordant och bildar ett större kristallviolett–jodkomplex. Därefter sker det kritiska avfärgningssteget med alkohol eller aceton–alkohol. Slutligen appliceras safranin eller fuksin som kontrastfärg.

Hos grampositiva bakterier dehydrerar alkoholen det tjocka peptidoglykanet och minskar dess porositet, så att färgkomplexet hålls kvar och cellerna förblir violetta. Hos gramnegativa bakterier extraheras lipider från det yttre membranet samtidigt som det tunna peptidoglykanet inte förmår kvarhålla komplexet. Cellerna avfärgas och blir därefter rosa eller röda av kontrastfärgen. Resultatet speglar alltså cellhöljets fysikaliska egenskaper, inte en enskild kemisk reaktion.

Svaret bör ange gramreaktion, form, storleksvariation och arrangemang, exempelvis ”grampositiva kocker i klasar”. I kliniska direktpreparat rapporteras även ungefärlig bakteriemängd, förekomst av leukocyter och vid behov epitelceller som mått på inflammation respektive provkvalitet. Gramvariabla arter och skadade bakterier bör beskrivas som sådana, inte tvingas in i en säker kategori.

Syrafasta, cellväggslösa och andra avvikande cellhöljen

Mykobakteriers hölje innehåller peptidoglykan bundet till arabinogalaktan, som i sin tur är förenat med långkedjiga mykolsyror. Den lipidrika, vaxartade barriären ger låg permeabilitet och bidrar till långsam tillväxt, motståndskraft mot uttorkning och begränsat antibiotikainträde. Den höga lipidhalten gör att mykobakterier ofta färgas svagt eller oregelbundet med Grammetoden.

Vid Ziehl–Neelsen-färgning drivs karbolfuksin in i höljet, traditionellt med uppvärmning. Kinyoun-metoden använder högre färgkoncentration utan motsvarande upphettning. Efter avfärgning med syraalkohol behåller syrafasta bakterier färgen; fluorokrommetoder med auraminbaserade färgämnen ger hög känslighet vid screening. Syrafasthet ska inte likställas med grampositivitet. Nocardia har kortare mykolsyror och är endast partiellt eller svagt syrafast.

Mycoplasma och andra Mollicutes saknar peptidoglykan och stabiliserar membranet med steroler. De är därför pleomorfa och naturligt resistenta mot betalaktamer och glykopeptider. Chlamydia har en avvikande intracellulär livscykel och visualiseras dåligt i rutinmässigt Gramfärgat material. Spiroketer är ofta för tunna för säker rutinmikroskopi. För dessa grupper krävs anpassat provval och ofta nukleinsyraamplifiering, antigenpåvisning, serologi, mörkfälts- eller specialfärgning i stället för enbart vanlig odling och Gramfärgning.

Cytoplasmamembran, energimetabolism och transport

Cytoplasmamembranet är ett fosfolipidbilager med integrala och perifera membranproteiner. Det fungerar som selektiv barriär och bär transportsystem, receptorer, sekretionapparater och enzymer för lipid- och cellväggssyntes. Många bakterier innehåller hopanoider som bidrar till membranstabilitet på ett sätt som delvis motsvarar sterolernas funktion. Steroler saknas vanligen, med det viktiga undantaget Mycoplasma, som tar upp dem från omgivningen.

Respiratoriska elektrontransportkedjor är lokaliserade till cytoplasmamembranet. Elektronflödet kopplas till förflyttning av protoner och skapar en protonmotorisk kraft, sammansatt av membranpotential och pH-gradient. Den elektrokemiska potentialen kan vara omkring 180 mV och driver ATP-syntas, sekundär aktiv transport och många flagellmotorer. Vissa bakterier använder natriumgradient i stället för protongradient för utvalda transport- eller motilitetsprocesser.

ABC-transportörer hydrolyserar ATP direkt för import eller export, medan symportörer och antiportörer kopplar transport till jonernas gradient. Membranfluiditeten regleras genom förändringar i fettsyrornas kedjelängd, mättnadsgrad och förgrening; vid kyla gynnas vanligen en sammansättning som motverkar stelning. Cytoplasmamembranet ska inte förväxlas med gramnegativa bakteriers yttre membran: endast det förra är den primära energikopplande och cytoplasmaavgränsande barriären.

Nukleoid, plasmider, ribosomer och cytoskelett

Bakteriekromosomen är vanligen cirkulär, dubbelsträngad och omkring 1–5 Mb. Den ligger supertvinnad i nukleoiden och organiseras av bland annat DNA-gyras, andra topoisomeraser och nukleoidassocierade proteiner såsom HU och H-NS. Det finns undantag med linjära kromosomer, exempelvis hos vissa Borrelia, och bakterier med mer än en kromosom. Avsaknaden av kärnmembran möjliggör koppling mellan transkription och translation.

Plasmider är självständigt replikerande DNA-molekyler, vanligen omkring 1–200 kb men ibland större. Kopietalet varierar från enstaka till många kopior per cell. Plasmider kan bära resistensgener, toxiner, adhesiner och metabola funktioner. Konjugativa plasmider kodar överföringsapparat och kan sprida genetiska egenskaper mellan bakterier; andra plasmider mobiliseras med hjälp av sådan apparatur. Förlust eller förvärv av plasmider kan därför snabbt ändra resistens- och virulensfenotyp utan att artidentiteten förändras.

Den bakteriella 70S-ribosomen består av 30S-subenheten med 16S-rRNA och 50S-subenheten med 23S- och 5S-rRNA. Skillnader mot eukaryota 80S-ribosomer möjliggör selektiv antibiotikabehandling: bland annat tetracykliner och aminoglykosider verkar mot 30S, medan makrolider, linkosamider och flera andra grupper påverkar 50S. FtsZ-ringen organiserar septation, MreB styr lateral peptidoglykaninsättning och störningar i systemen ger filamentering, sfärisk omvandling eller felplacerade septa.

Flageller, pili och fimbrieapparat

En bakteriell flagell består av filament, krok och basalkropp. Filamentet är omkring 20 nm i diameter och kan nå cirka 15 µm; det byggs huvudsakligen av flagellin. Den ungefär 55 nm långa kroken fungerar som en flexibel koppling. Basalkroppen förankras i cellhöljet och innehåller en roterande motor som drivs av proton- eller natriumflöde över cytoplasmamembranet.

Vid kemotaxi påverkar kemoreceptorer rotationsriktningen genom Che-signalering. Hos peritrikt flagellerade bakterier ger samordnad rotation ett flagellknippe och riktad simning, medan ändrad rotation löser upp knippet och orsakar tumbling. Genom att förlänga simningsfaser i gynnsam riktning uppstår nettomigration mot attraktanter och bort från repellenter, trots att varje enskild rörelsesekvens innehåller ett slumpmässigt moment.

Fimbriae är vanligen korta och talrika och medierar adhesion. Typ 1-fimbriers FimH kan binda mannosinnehållande receptorer i urinvägarna och bidra till urinvägsinfektion; andra adhesiner initierar kolonisation och biofilm. Konjugativa pili skapar kontakt för DNA-överföring. Typ IV-pili förlängs och dras tillbaka med ATP-drivna motorer, vilket möjliggör twitchingmotilitet, adhesion och hos vissa arter upptag av exogent DNA.

Kapsel, slemlager, S-lager och biofilm

En kapsel är ett organiserat och fast bundet extracellulärt lager, medan ett slemlager är diffust och lättare lossnar från cellen. De flesta kapslar består av polysackarider. Streptococcus pyogenes har en hyaluronsyrakapsel som liknar värdens extracellulära komponenter, medan Bacillus anthracis har en ovanlig kapsel av poly-D-glutamat. Kapsel kan påvisas genom negativfärgning, kapselsvällningsreaktion eller antigenanalys.

Kapseln kan minska fagocytos och påverka komplementdeposition, samtidigt som dess vattenbindande egenskaper skyddar mot uttorkning. Den kan också underlätta adhesion. Kapselantigen är därför viktiga virulensmarkörer och används för serotypning och i vissa vacciner. Kapseluttrycket kan gå förlorat under laboratorieodling, vilket innebär att en okapslad odlingsisolat inte alltid speglar fenotypen i värden.

Biofilmsbildning börjar med reversibel kontakt, följd av stabil adhesion och tillväxt av mikrokolonier. Bakterierna producerar en extracellulär matrix av polysackarider, proteiner, lipider och extracellulärt DNA. I mogen biofilm uppstår gradienter av syre, pH och näring samt långsamväxande subpopulationer, vilket minskar antibiotikaeffekt och främjar persisterande infektioner. S-lager är separata, 5–25 nm tjocka parakristallina proteinlager med regelbundna porer på cirka 2–8 nm; de kan ge mekaniskt skydd, molekylär sållning och adhesion.

Endosporer, intracellulära membran och inklusioner

Sporulering utlöses vanligen av näringsbrist. Efter kromosomreplikation bildas ett asymmetriskt septum som avskiljer en förspor. Modercellen omsluter denna, så att försporen omges av dubbla membran. Mellan membranen byggs ett modifierat peptidoglykanlager, cortex, och utanför detta anläggs flera lager av sporkappeproteiner. Modercellen lyserar slutligen och frisätter den mogna endosporen.

Sporens kärna är starkt dehydrerad. Kalcium–dipikolinat bidrar till låg vattenhalt och värmestabilitet, medan små syralösliga sporproteiner binder och skyddar DNA. Cortex och sporkappa begränsar penetration av kemikalier och enzymer. Kombinationen ger hög resistens mot värme, uttorkning, strålning och många desinfektionsmedel. Endosporen är en överlevnadsform, inte en reproduktiv spor: en vegetativ cell bildar en endospor, som vid groning ger en vegetativ cell.

Terminalt, subterminalt eller centralt sporlager och eventuell utbuktning av modercellen kan stödja identifiering av Bacillus- och Clostridium-relaterade bakterier. Sporer är kliniskt betydelsefulla vid bland annat miljööverlevnad och smittspridning; de kräver validerade steriliseringsmetoder och kan överleva åtgärder som avdödar vegetativa bakterier.

Intracellulära membran förekommer bland annat hos fototrofa och metanoxiderande bakterier och ökar ytan för specialiserade reaktionskedjor. Proteinbaserade mikrokompartment, exempelvis karboxysomer, omsluter enzymatiska system utan lipidmembran. Klassiska ”mesosomer”, som tidigare beskrevs som membranveck för respiration eller celldelning, är däremot artefakter orsakade av kemisk fixering inför elektronmikroskopi.

Från fenotyp till klinisk klassificering och artbestämning

Den första diagnostiska avgränsningen bygger ofta på direktmikroskopi och odlingsfenotyp. Gramreaktion kombineras med form, arrangemang, sporbildning och eventuell syrafasthet. Därefter bedöms tillväxt i olika syreförhållanden, motilitet, kolonistorlek, pigment, lukt och hemolys. Resultaten leder till ett riktat urval av snabbtester och identifieringsmetoder.

Katalas skiljer exempelvis stafylokocker från streptokocker och enterokocker, koagulas stödjer identifiering av Staphylococcus aureus och oxidas avgränsar vissa gramnegativa grupper. Testerna är emellertid inte absoluta. Odlingsmedium, temperatur, inkubationstid, syretillgång och antibiotikaexponering påverkar enzymuttryck, pigment, hemolys, kapsel, cellform och kolonimorfologi. Blandkulturer och kontamination kan dessutom ge motsägelsefulla resultat.

MALDI-TOF-masspektrometri identifierar många odlade isolat genom deras proteinprofil. Riktad PCR är lämplig när en bestämd patogen eller resistensmarkör misstänks, medan 16S-rRNA-sekvensering är värdefull vid svåridentifierade bakterier eller odlingsnegativa infektioner. Helgenomsekvensering ger högst upplösning för taxonomi, resistensmekanismer och smittspårning. Genotypiska fynd måste ändå relateras till provtyp, klinik och fenotypisk resistensbestämning.

Strukturell klassifikation påverkar empiriskt antibiotikaval eftersom yttre membran, peptidoglykan, mykolsyror och avsaknad av cellvägg styr läkemedelspenetration och målstruktur. Den påverkar också laboratoriets säkerhetsrutiner, provtransport, odlingsbetingelser och smittskydd. Gramreaktion och morfologi är således snabba kliniska beslutsunderlag, men får aldrig likställas med säker artidentitet eller genetiskt släktskap.

Källor

• Bacterial cell structure
• Bacterial cell structure
• Bild: File:Bacterial cell structure.png — Nejash Abdela, CC BY-SA 4.0
• Bild: File:Bacterial locomotion.jpg — Julio Bastos-Arrieta, Ainhoa Revilla-Guarinos, William E. Uspal och Juliane Simmchen, CC BY-SA 4.0