Cellkärnan och nukleolen

Cellkärnan organiserar och skyddar det eukaryota genomet genom ett selektivt permeabelt kärnhölje och en hierarkisk kromatinarkitektur. I kärnan bildar nukleolen ett dynamiskt, membranlöst kondensat där ribosomalt RNA transkriberas och bearbetas samt ribosomala subenheter monteras och kvalitetskontrolleras.

Cellkärnans avgränsning, morfologi och förekomst

Cellkärnan är den DNA-innehållande organell som avgränsar huvuddelen av genomet från cytoplasman i eukaryota celler. Den omfattar kärnhöljet och dess innehåll: nukleoplasma, kromatin och olika membranlösa kärnkroppar. Nukleoplasman är den vattenhaltiga miljö där bland annat transkription, RNA-bearbetning, DNA-replikation och DNA-reparation sker. Kromatin är komplexet av DNA, histoner och andra kromatinassocierade proteiner, medan nukleolen är ett intranukleärt kondensat som framför allt organiserar ribosombiogenesen.

En typisk däggdjurskärna har en diameter på cirka 5–10 µm, men variationen är betydande. Storleken påverkas av celltyp, genomstorlek, ploiditet, differentieringsgrad och cellcykelfas. Polyploida hepatocyter och megakaryocyter kan ha stora och ibland lobulerade kärnor, medan små vilande lymfocyter har täta, relativt små kärnor med hög kärna–cytoplasmakvot. Under S- och G2-fas ökar DNA-innehållet från 2C mot 4C utan att kärnvolymen nödvändigtvis fördubblas proportionellt.

Mogna humana erytrocyter är anukleära och saknar därför både genomisk transkription och nukleol. Trombocyter är också kärnlösa men innehåller RNA och cytoplasmatiska organeller från megakaryocyten. Skelettmuskelfibrer uppkommer genom fusion av myoblaster och innehåller många perifert belägna kärnor. Även andra syncytier, exempelvis syncytiotrofoblast, innehåller flera genom inom en gemensam cytoplasma.

I ljusmikroskopi framträder kärnan genom DNA-bindande färgämnen eller hematoxylin. Nukleolen ses ofta som en rundad, starkt refraktil eller mörkt färgad struktur, men innehåller inte något eget avgränsande membran. Elektronmikroskopi skiljer bättre mellan elektrontätt heterokromatin, ljusare eukromatin och nukleolens fibrillära respektive granulära delar.

Kärnhöljet och den nukleära lamina

Kärnhöljet består av ett inre och ett yttre kärnmembran, båda uppbyggda som fosfolipidbilager. Mellan membranen finns det perinukleära rummet, vanligen cirka 30–50 nm brett. Det yttre kärnmembranet står i direkt kontinuitet med endoplasmatiskt retikel och kan, liksom granulärt endoplasmatiskt retikel, bära ribosomer på den cytoplasmatiska sidan. Det perinukleära rummet är kontinuerligt med ER-lumen.

Det inre kärnmembranet har en särskild proteinsammansättning och är kopplat till den nukleära lamina, ett intermediärfilamentliknande nätverk på den nukleoplasmatiska sidan. Lamina byggs huvudsakligen av laminer A och C, som är alternativa produkter från LMNA, samt B-typ-laminer. B-laminer uttrycks brett och förblir membranassocierade genom lipidmodifiering, medan lamin A genomgår ytterligare proteolytisk mognad.

Lamina ger kärnan mekanisk stabilitet och påverkar kärnans form, position och motståndskraft mot deformation. Den bidrar också till att förankra kärnporkomplex och organiserar laminaassocierade kromatindomäner, LAD, som ofta är genfattiga och transkriptionssvaga. Kontakten är dock dynamisk: gener kan flyttas till eller från kärnperiferin när en cell differentieras eller ändrar transkriptionsprogram.

LINC-komplexet, linker of nucleoskeleton and cytoskeleton, överför mekaniska krafter genom kärnhöljet. SUN-proteiner i det inre kärnmembranet binder KASH-domänproteiner i det yttre membranet, vilka i sin tur kopplas till aktinfilament, mikrotubuli eller intermediärfilament. Systemet är viktigt för kärnpositionering, mekanotransduktion och migration genom trånga vävnadsutrymmen.

Mutationer i laminer eller laminassocierade proteiner orsakar laminopatier. Exempel är Emery–Dreifuss muskeldystrofi, vissa dilaterade kardiomyopatier, familjär partiell lipodystrofi och Hutchinson–Gilfords progerisyndrom. Defekterna kan ge kärnblåsor, bristningar i kärnhöljet, felaktig kromatinorganisation och ökad DNA-skada, särskilt i mekaniskt belastade vävnader som skelettmuskel och myokard.

Kärnporer och selektiv nukleocytoplasmatisk transport

Kärnporkomplexet är en mycket stor proteinstruktur som spänner över båda kärnmembranen. Det har åttafaldig rotationssymmetri och består av upprepade kopior av omkring 30 olika nukleoporiner. Strukturen omfattar ringkomplex, en central transportkanal, cytoplasmatiska filament och en nukleär korg. En däggdjurskärna innehåller vanligen tusentals kärnporer, men tätheten varierar med celltyp och metabol aktivitet.

Den selektiva barriären bildas främst av nukleoporiner rika på fenylalanin–glycin-motiv, FG-nukleoporiner. Små molekyler och vissa mindre proteiner passerar genom passiv diffusion. Gränsen är inte absolut: transporthastigheten avtar gradvis med ökande storlek, form och interaktion med porens miljö. Stora proteiner, ribonukleoproteiner och ribosomala prekursorer kräver i regel receptorförmedlad transport.

Proteiner avsedda för kärnan kan bära en nukleär lokaliseringssignal, NLS, ofta rik på lysin och arginin. Signalen känns igen av importiner. Importin–last-komplexet interagerar med FG-nukleoporiner och passerar poren, varefter Ran-GTP i kärnan binder importreceptorn och frigör lasten. Export sker analogt när en nukleär exportsignal, NES, känns igen av en exportin, exempelvis CRM1/XPO1.

Transportens riktning upprätthålls av en Ran-nukleotidgradient. RCC1, en kromatinbunden guaninnukleotidutbytesfaktor, bildar Ran-GTP i kärnan. Cytoplasmatiskt RanGAP stimulerar hydrolys till Ran-GDP. Importkomplex dissocieras därför i kärnan, medan exportkomplex bildas där och faller sönder efter GTP-hydrolys i cytoplasman.

Bulkexport av mRNA sker huvudsakligen Ran-oberoende genom NXF1 med kofaktorer. mRNA måste först packas till ett moget messenger-ribonukleoproteinkomplex, och felaktigt processade transkript hålls normalt kvar och bryts ned. Transportfel kan ge nukleär eller cytoplasmatisk proteinansamling, förändrad transkription och störd RNA-metabolism. Sådana mekanismer är relevanta vid bland annat cancer, virusinfektioner och neurodegenerativa sjukdomar.

Kromatinets grundstruktur: nukleosomer och kompakteringsgrader

Den cirka två meter långa DNA-molekyl som finns i en diploid human cell måste packas i en kärna med mikrometerdimensioner utan att förlora reglerad åtkomlighet. Grundelementet är nukleosomen. Omkring 147 baspar DNA är lindade ungefär 1,7 varv runt en histonoktamer bestående av två kopior vardera av H2A, H2B, H3 och H4.

Mellan nukleosomerna ligger linker-DNA av varierande längd. Linkerhistonen H1 binder nära DNA:s in- och utträde ur nukleosomen och kan stabilisera mer kompakterade tillstånd. Nukleosomkedjan bildar emellertid inte nödvändigtvis en regelbunden hierarki. Den klassiska 30-nm-fibern är väl definierad i vissa experimentella system men betraktas inte som en universell, kontinuerlig struktur i levande celler.

Histonvarianter ger nukleosomer särskilda egenskaper. CENP-A markerar centromeriskt kromatin, medan H2A.Z och H3.3 förekommer i reglerade genomiska sammanhang. ATP-beroende kromatinremodellerare kan flytta, avlägsna eller byta ut nukleosomer och därigenom ändra åtkomsten för transkriptionsfaktorer, polymeraser och reparationsproteiner.

DNA-metylering och posttranslationella histonmodifieringar påverkar kromatinets proteinbindning och fysisk-kemiska egenskaper. Histonacetylering förknippas ofta med ökad tillgänglighet, medan vissa metyleringar är associerade med antingen aktiva eller repressiva regioner beroende på vilken aminosyra och metyleringsgrad som avses. En enskild modifiering är därför sällan en entydig av- eller på-signal; effekten beror på kombinationer, läsarproteiner och genomiskt sammanhang.

Genomets tredimensionella organisation och kärnans funktionella domäner

Interfaskromosomer ligger inte slumpmässigt blandade utan upptar överlappande kromosomterritorier. Inom territorierna kan kromatinet indelas i A- och B-kompartment. A-kompartment är i genomsnitt mer genrika, transkriptionsaktiva och tidigt replikerande, medan B-kompartment oftare är kompakterade, laminaassocierade och sent replikerande.

På mindre skala identifieras topologiskt associerade domäner, TAD, där DNA-segment statistiskt har fler kontakter inom domänen än över dess gränser. CTCF och cohesin bidrar till många sådana strukturer genom loop-extrusion: cohesin rör sig längs kromatinet och förstorar en loop tills komplexet hejdas, ofta av orienterade CTCF-bindningsställen. Detta kan föra enhancers nära promotorer men kan också isolera gener från olämpliga regulatoriska element.

Laminaassocierade domäner finns nära kärnperiferin, medan nukleolassocierade domäner, NAD, kontaktar nukleolen. Båda är ofta berikade på repetitivt och transkriptionssvagt kromatin. Organisationen samordnas med replikationstidpunkt, transkription och reparationsväg; ett DNA-brotts position och kromatinmiljö kan påverka vilka reparationsfaktorer som får tillträde.

Kärnan innehåller dessutom nukleära speckles, som är rika på splitsningsfaktorer, Cajal-kroppar med roller i mognad av små RNP-komplex samt PML-kroppar som deltar i stressreaktioner, antiviral kontroll och proteinmodifiering. Dessa kroppar saknar membran och uppkommer genom riktad rekrytering och multivalenta molekylära interaktioner.

3C, Hi-C och närbesläktade metoder mäter ligationsfrekvens mellan DNA-regioner som befunnit sig nära varandra. Resultaten är ofta populationsmedelvärden från många celler och representerar kontaktsannolikheter, inte en enda statisk kärnstruktur. En uppmätt kontakt visar inte automatiskt att två regioner interagerar funktionellt eller befinner sig nära varandra i varje enskild cell.

Nukleolens morfologi, delkompartment och materialegenskaper

Nukleolen är ett dynamiskt, icke-membranbundet kondensat som bildas kring transkriptionsaktiva nukleolorganiserande regioner. I humana celler är den ofta cirka 1–3 µm stor, och en kärna uppvisar vanligen 1–5 nukleoler. Flera kromosomala NOR kan bidra till samma nukleol, varför nukleolantalet inte motsvarar antalet rDNA-arrayer.

Elektronmikroskopiskt kan tre huvudkompartment urskiljas. Fibrillära centra, FC, innehåller rDNA och transkriptionsfaktorer såsom UBF samt RNA-polymeras I. Runt dessa ligger den täta fibrillära komponenten, DFC, där tidiga bearbetnings- och modifieringssteg sker; fibrillarin är en viktig markör. Den granulära komponenten, GC, innehåller senare preribosomala partiklar och är rik på nukleofosmin, NPM1.

Nukleolens organisation drivs av multivalenta RNA–RNA-, RNA–protein- och protein–proteininteraktioner. Intrinsiskt oordnade proteinregioner och den höga lokala koncentrationen av pre-rRNA möjliggör fasseparation. De olika komponenterna har skilda ytspänningar och interaktionsnätverk och kan därför bilda ett flerfasigt kondensat med inbördes ordnade skikt.

Kondensatet är inte en passiv vätskedroppe. ATP-beroende helicaser, RNA-processning och kontinuerlig transport av molekyler håller det utanför termodynamisk jämvikt. FRAP visar att många nukleolära proteiner omsätts snabbt, även om mobiliteten varierar mellan proteiner och delkompartment. ATP-brist, hämmad transkription och förändrad jonmiljö kan minska fluiditeten och omorganisera strukturen.

Ribosomalt DNA och nukleolorganiserande regioner

Humant ribosomalt DNA, rDNA, är organiserat i tandemrepeterade enheter om cirka 43 kb. Arrayerna finns i nukleolorganiserande regioner på de korta armarna av de akrocentriska kromosomerna 13, 14, 15, 21 och 22. En diploid cell har därmed tio kromosomala NOR, men endast en del behöver vara aktivt engagerade i synliga nukleoler.

Det diploida genomet innehåller vanligen ungefär 300–400 rDNA-kopior. Kopietalet varierar mellan individer, och alla kopior är inte transkriptionsaktiva. I en viss cell kan en fraktion vara aktiv, en annan tillfälligt inaktiv och ytterligare kopior mer varaktigt epigenetiskt tystade. DNA-metylering, histonmodifieringar och kromatinremodellering bidrar till detta urval.

Varje repetitionsenhet innehåller en promotor, den transkriberade region som ger upphov till pre-rRNA och en intergen spacer som skiljer enheten från nästa. Den transkriberade regionen omfattar sekvenserna för 18S-, 5,8S- och 28S-rRNA samt yttre och inre transkriberade spacersekvenser. Spacersekvenserna avlägsnas under mognaden.

rDNA är särskilt svårt att analysera genom standardsekvensering eftersom de många snarlika kopiorna ger tvetydig mappning. Tandemorganisationen medför dessutom risk för felaktig homolog rekombination, kopietalsförändringar och strukturell instabilitet. Replikationsgafflar kan kollidera med den mycket intensiva transkriptionen, vilket kräver koordinerad replikation, topologisk kontroll och DNA-reparation.

RNA-polymeras I och syntesen av prekursor-rRNA

Transkription av rDNA kräver ett specialiserat preinitieringskomplex. UBF binder regulatoriska rDNA-sekvenser och bidrar till en transkriptionskompetent kromatinstruktur. Promotorselektivitetsfaktorn SL1 innehåller TBP och RNA-polymeras I-specifika TBP-associerade faktorer. Tillsammans med ytterligare initieringsfaktorer positionerar komplexet RNA-polymeras I vid promotorn.

Efter initiering lämnar polymeraset promotorn och elongeringen fortgår genom rDNA-enheten. Många polymeraser kan samtidigt transkribera samma gen, vilket ger den karakteristiska så kallade julgransbilden i elektronmikroskopi: DNA utgör stammen och växande pre-rRNA-transkript grenar sig med ökande längd. I starkt prolifererande celler ligger produktionen i storleksordningen tusentals prekursortranskript per minut.

Det primära humana transkriptet benämns 47S pre-rRNA. Efter mycket tidiga klyvningar används ofta beteckningen 45S. Prekursorn innehåller i ordning en 5′-ETS, 18S-sekvens, ITS1, 5,8S-sekvens, ITS2, 28S-sekvens och 3′-ETS. Varken ETS- eller ITS-regionerna finns kvar i den mogna ribosomen.

RNA-polymeras I regleras på flera nivåer. Tillväxtfaktorer och MYC ökar uttrycket av ribosomala komponenter och kan stimulera både Pol I-transkription och ribosomproteinproduktion. mTOR kopplar aminosyror, energi och tillväxtsignaler till ribosombiogenesen. Vid näringsbrist, hypoxi eller energibrist minskar Pol I-aktiviteten, vilket sparar betydande mängder ATP och nukleotider.

Den höga aktiviteten gör systemet känsligt för proliferationssignaler och onkogen aktivering. Samtidigt behöver ökad Pol I-transkription balanseras mot pre-rRNA-bearbetning och tillgången på ribosomala proteiner. Obalans leder till ansamling av ofullständiga partiklar och kan aktivera nukleolär stress.

Pre-rRNA-bearbetning och kemisk modifiering

47S-prekursorn bearbetas genom en ordnad men delvis parallell serie endonukleolytiska klyvningar och exonukleolytisk trimning. Sekvenser i 5′- och 3′-ETS avlägsnas, varefter klyvningar i ITS1 skiljer prekursorn till den lilla subenheten från den stora subenhetens intermediärer. ITS2 avlägsnas under mognaden av 5,8S- och 28S-rRNA.

De mogna produkterna är ungefär 1 900 nukleotider långt 18S-rRNA, cirka 160 nukleotider långt 5,8S-rRNA och cirka 5 000 nukleotider långt 28S-rRNA. Exakta intermediärer och ordningsföljder kan variera mellan celltyper och fysiologiska tillstånd. 18S bildar kärnan i den lilla subenheten, medan 5,8S och 28S ingår i den stora.

Små nukleolära RNP-komplex, snoRNP, styr många kemiska modifieringar genom basparning mellan ett guide-RNA och pre-rRNA. Box C/D-snoRNP innehåller fibrillarin, som katalyserar 2′-O-metylering av ribosens hydroxylgrupp. Box H/ACA-snoRNP innehåller dyskerin, som isomeriserar uridin till pseudouridin.

Humant rRNA innehåller sammanlagt över 200 modifierade positioner. Modifieringarna samlas särskilt i funktionellt viktiga delar, såsom peptidyltransferascentrum och dekodningscentrum, och påverkar veckning, stabilitet och ribosomfunktion. De bör inte betraktas som enbart dekorativa slutmodifieringar; många införs kotranskriptionellt och styr korrekt monteringsordning.

Felaktiga intermediärer och avklippta spacersekvenser måste elimineras. RNA-exosomen med associerade nukleaser bryter ned många aberranta eller överflödiga RNA-fragment, medan XRN2 utför 5′→3′-nedbrytning och trimning av vissa produkter. Bristande kvalitetskontroll kan ge defekta subenheter, nukleolär stress och förändrad translation.

Sammansättning, mognad och export av ribosomala subenheter

Ribosomala proteiner kodas av kärngener som transkriberas av RNA-polymeras II. Deras pre-mRNA splitsas och exporteras, varefter proteinerna syntetiseras på cytoplasmatiska ribosomer. De nybildade ribosomala proteinerna importeras sedan genom kärnporerna och koncentreras i kärna och nukleol med hjälp av nukleära och nukleolära lokaliseringssignaler.

5S-rRNA följer en annan väg. Det transkriberas av RNA-polymeras III från gener utanför NOR i nukleoplasman och förs därefter till den blivande stora subenheten. Tillsammans med bland annat RPL5 och RPL11 bildar det en 5S-RNP som inkorporeras i pre-60S-partikeln.

Pre-40S byggs kring 18S-rRNA, medan pre-60S innehåller 28S-, 5,8S- och 5S-rRNA. Processen omfattar mer än 200 övergående monteringsfaktorer, däribland nukleaser, helicaser, GTPaser, ATPaser och chaperoner. Dessa faktorer hjälper RNA att veckas, förhindrar förtida interaktioner och kontrollerar att kritiska strukturer bildas i rätt ordning.

Partiklarna lämnar nukleolen för ytterligare mognad i nukleoplasman. Export genom kärnporerna kräver exportadaptrar och exportreceptorer; CRM1/XPO1 och Ran-GTP är centrala, särskilt för pre-60S. Partiklarna är mycket större än den passiva diffusionsgränsen och måste genomgå omfattande strukturell omorganisation för att passera porkomplexet.

I cytoplasman avlägsnas återstående monteringsfaktorer och subenheterna genomgår funktionella kontrollsteg. Först därefter kan mogna 40S- och 60S-subenheter associera kring ett mRNA och bilda den eukaryota 80S-ribosomen. Beteckningen 80S är en sedimentationskoefficient och är inte den aritmetiska summan av 40 och 60.

Kärna och nukleol under cellcykeln

Under S-fas replikeras DNA i rumsligt avgränsade replikationsdomäner. Tidigt replikerande domäner är ofta genrika och transkriptionsaktiva, medan perifert heterokromatin vanligen replikeras senare. Replikationsmaskineriet måste samtidigt samordnas med transkription och återetablering av nukleosomer på dottersträngarna.

Humana celler genomgår öppen mitos. CDK1–cyklin B fosforylerar komponenter i lamina, kärnporkomplex och kromatinassocierade system. Lamina depolymeriseras, kärnporerna demonteras och kärnhöljet övergår till membranstrukturer som står i kontinuitet med ER. Därmed får den mitotiska spolen tillträde till kromosomerna.

RNA-polymeras I-transkription stängs av i profas, samtidigt som nukleolens protein- och RNA-komponenter sprids. Den integrerade nukleolen försvinner därför som mikroskopisk struktur. UBF kan emellertid stanna kvar på transkriptionskompetenta NOR och fungerar som en mitotisk markering som underlättar snabb återstart.

När CDK1-aktiviteten sjunker i telofas defosforyleras laminer och nukleoporiner. Kärnhöljet återbildas kring de separerade kromosomuppsättningarna, kärnporer monteras och nukleär transport återupptas. Pol I-aktivitet startar vid aktiva NOR, bearbetningsfaktorer rekryteras och små prenukleolära kroppar sammansmälter till nya nukleoler under tidig G1.

Alla eukaryoter använder inte öppen mitos. Vid sluten mitos, exempelvis hos vissa svampar, förblir kärnhöljet i huvudsak intakt och spolen organiseras inne i kärnan. Partiellt öppen mitos innebär begränsad permeabilisering eller ombyggnad av kärnhöljet. Kärnporernas och nukleolens dynamik måste därför tolkas i relation till organism och celltyp.

Fysiologisk variation och nukleolär stress

Kärnans utseende speglar cellens funktionella tillstånd. Terminalt differentierade eller vilande celler har ofta mer kondenserat kromatin, medan hög transkriptionsaktivitet kan ge öppnare kromatin och tydliga nukleoler. Kärnstorlek och kärna–cytoplasmakvot påverkas även av ploiditet, cellsvullnad, fixering och vävnadsarkitektur.

Nukleolernas antal och sammanlagda volym varierar med tillväxt, näringstillgång och proliferationshastighet. Stora nukleoler talar ofta för hög Pol I-aktivitet och ribosomproduktion, men fyndet är inte specifikt för malignitet. Även normala sekretoriska celler, regenererande vävnad och aktiverade lymfocyter kan ha framträdande nukleoler.

Nukleolär stress uppstår när rRNA-transkription, bearbetning eller ribosommontering störs. Då inkorporeras 5S-RNP-komponenterna RPL5 och RPL11 inte normalt i pre-60S. De ansamlas i nukleoplasman och binder MDM2, den E3-ubikvitinligas som under basala förhållanden främjar p53-ubikvitinering och proteasomal nedbrytning.

När MDM2 hämmas stabiliseras p53. Detta kan inducera p21-medierat cellcykelstopp, senescens eller apoptos beroende på skadans grad och cellens övriga signalmiljö. Mekanismen förklarar varför partiella ribosombiogenesdefekter kan ge kraftiga biologiska effekter trots att ribosomer fortfarande produceras.

Det finns också p53-oberoende stressreaktioner genom förändrad MYC-signalering, translation, DNA-skaderespons och nukleolär proteinlokalisering. Morfologiskt kan Pol I-hämning ge nukleolär segregering, där fibrillära komponenter bildar perifera kapslar och den granulära komponenten omorganiseras. Ett sådant fynd är ett stressmönster, inte en etiologisk diagnos.

Icke-ribosomala funktioner och klinisk betydelse

Nukleolen kan temporärt behålla regulatoriska proteiner och därmed begränsa deras tillgänglighet i nukleoplasma eller cytoplasma. Den deltar även i mognaden av vissa RNP-komplex, och telomeras-RNA passerar eller associerar under vissa mognadssteg med nukleolära och Cajal-kroppsrelaterade system. Fynden är ofta cell- och stressberoende och bör inte likställas med nukleolens väletablerade huvudfunktion i ribosombiogenes.

rDNA:s repetitiva struktur och intensiva transkription gör nukleolen central för genomstabilitet. Replikations–transkriptionskonflikter, R-loopar och felaktig rekombination kan skapa DNA-brott eller kopietalsförändringar. Virus och andra patogener kan dessutom omdirigera nukleolin, NPM1 och andra nukleolära proteiner för viral RNA-export, translation eller hämning av värdcellens proteinsyntes.

Ribosomopatier uppkommer när ribosomala proteiner eller monteringsfaktorer är defekta. Diamond–Blackfans anemi orsakas ofta av heterozygota varianter i ribosomproteingener, exempelvis RPS19, och karakteriseras av nedsatt erytropoes. Vid 5q−-syndrom bidrar haploinsufficiens av RPS14 till ineffektiv erytropoes och makrocytär anemi. Vävnadsspecificiteten anses bero på en kombination av p53-aktivering, höga ribosomkrav och cellspecifik translation.

Dyskeratosis congenita kan orsakas av defekter i bland annat dyskerin eller telomerasrelaterade komponenter. Dyskerin deltar både i H/ACA-snoRNP-medierad pseudouridinylering och i telomeras-RNP. Sjukdomsbilden kan därför omfatta benmärgssvikt, mukokutana fynd, lungfibros och cancerpredisposition genom kombinerad telomer- och ribosomdysfunktion.

Nukleolär dysfunktion förekommer även vid laminopatier och neurodegeneration, där störd kärntransport, RNA-metabolism och proteinaggregation kan påverka ribosombiogenesen. Sambanden är ofta multifaktoriella; en förändrad nukleol kan vara både orsak, förstärkande mekanism och konsekvens av cellulär stress.

Mutation i NPM1 förekommer i ungefär en tredjedel av vuxen akut myeloisk leukemi. Mutationerna skapar vanligen en förändrad C-terminal och en förstärkt nukleär exportsignal, vilket leder till diagnostiskt karakteristisk cytoplasmatisk NPM1-lokalisering. Immunhistokemisk påvisning av cytoplasmatiskt NPM1 kan därför stödja diagnosen, men molekylär analys krävs för exakt mutationsbestämning och uppföljning.

AgNOR-färgning visualiserar silverbindande proteiner associerade med aktiva nukleolorganiserande regioner. Ökat antal eller större AgNOR-signaler kan korrelera med proliferation och malignitetsgrad men har begränsad specificitet. Resultatet påverkas av preparering, cellcykelfas, snittplan och hur sammanflytande signaler räknas.

RNA-polymeras I är ett behandlingsmål eftersom många cancerceller är beroende av hög ribosomproduktion. Pol I-hämning kan både minska ribosomkapaciteten och utlösa nukleolär stress. Effekten behöver inte vara helt p53-beroende, och vissa substanser påverkar dessutom DNA-struktur eller DNA-skaderespons. Terapeutiskt fönster, benmärgstoxicitet och effekter på annan snabbt prolifererande vävnad är centrala begränsningar.

Undersökningsmetoder, kvantifiering och felkällor

Kärna och nukleol kan studeras från morfologisk till genomisk nivå. Ljusmikroskopi, faskontrast och rutinmässig hematoxylin–eosinfärgning ger vävnadssammanhang, medan DAPI och Hoechst märker DNA. Nukleolen framträder ofta indirekt som en DNA-fattigare struktur omgiven av kromatin; färgningen visar inte specifikt pre-rRNA eller aktiv ribosombiogenes.

Immunfluorescens mot lamin A/C eller B avgränsar kärnperiferin och kan påvisa onormal kärnform. UBF och RNA-polymeras I markerar transkriptionsrelaterade delar, fibrillarin DFC och NPM1 framför allt GC. Multiplexfärgning ger därför mer information än en enskild markör och kan skilja generell nukleolförstoring från nukleolär segregering.

EU, 5-etynyluridin, eller radioaktiv uridin kan användas för att mäta nysyntetiserat RNA. Kort pulsmärkning ger stark nukleolär signal eftersom rRNA-produktionen är mycket hög. RNA-FISH med prober mot ETS eller ITS skiljer pre-rRNA från moget rRNA och kan lokalisera specifika bearbetningsintermediärer.

Elektronmikroskopi ger den bästa klassiska upplösningen av FC, DFC och GC. Superupplösningsmetoder möjliggör analys av subkompartment i fixerade eller levande celler. FRAP mäter hur snabbt fluorescerande molekyler återkommer efter lokal fotoblekning och används för att uppskatta mobil fraktion och utbyteskinetik, men fullständig signalåterkomst bevisar inte i sig idealiskt vätskeliknande beteende.

ChIP-seq, ATAC-seq och Hi-C analyserar proteinbindning, kromatinåtkomst respektive tredimensionella kontakter. rDNA:s repetitiva sekvenser medför dock att många läsningar inte kan placeras på en unik kopia. Specialiserade referenser, långa sekvensläsningar och kopietalsanpassade analyser behövs för att undvika att aktiva och inaktiva repetitioner blandas ihop.

Fixering kan krympa eller expandera kärnan, extrahera lösliga proteiner och förändra kondensatens morfologi. Snittplanet avgör om en nukleol ses i sin största diameter, och flera överlappande nukleoler kan felaktigt räknas som en. DNA-färgämnen har sekvenspreferenser, medan antikroppar kan korsreagera eller förlora epitoper beroende på fixativ.

Studier i levande celler har andra felkällor. Fluorescerande taggar kan ändra proteinets laddning, oligomerisering eller lokalisation, och överuttryck kan i sig driva kondensation. ATP-brist förändrar både aktiva remodelleringsprocesser och molekylär diffusion. Resultat om fasseparation bör därför stödjas av flera metoder, endogena uttrycksnivåer och kontroller av cellens energi- och stressstatus.

Källor

• Nucleolus
• Nukleol
• Category:Nucleolus
• Nucleolus
• Bild: File:Nucleus Nucleolus and chromatin of animal cell.png — Dan, CC BY-SA 3.0
• Bild: File:Nucleus&Nucleolus.gif — Okänd upphovsperson, Public domain