DNA:s struktur och organisation

DNA är en topologiskt reglerad dubbelhelix som i människans cellkärna organiseras från nukleosomer till dynamiska kromatindomäner, kromosomterritorier och mitotiska kromosomer. Organisationen komprimerar cirka två meter DNA, styr åtkomsten vid transkription, replikation och reparation och kan vid strukturella eller epigenetiska störningar orsaka utvecklingssjukdom, genominstabilitet och cancer.

DNA-molekylens kemiska och fysikaliska struktur

DNA är en polymer av deoxiribonukleotider. Varje nukleotid består av en kvävebas — purinerna adenin och guanin eller pyrimidinerna cytosin och tymin — bunden till 2-deoxiribos, samt en eller flera fosfatgrupper. Basen binds med en N-glykosidbindning till sockrets 1′-kol, medan fosfatet i polymeren förenar 3′-hydroxylgruppen i en deoxiribos med 5′-kolet i nästa nukleotid. Därmed bildas 3′–5′-fosfodiesterbindningar och en riktad ryggrad med en 5′-ände och en 3′-ände. Fosfatgrupperna är negativt laddade vid fysiologiskt pH, vilket påverkar DNA:s interaktion med katjoner, histoner och andra DNA-bindande proteiner.

Dubbelhelixens två strängar är antiparallella: den ena löper 5′→3′ och den andra 3′→5′. Adenin basparar med tymin genom två vätebindningar och guanin med cytosin genom tre. Komplementariteten möjliggör mallstyrd replikation och transkription, men vätebindningarna är inte ensamma ansvariga för helixens stabilitet. Hydrofoba basstaplingsinteraktioner, van der Waals-krafter och uteslutning av baserna från vatten ger ett stort energibidrag. GC-rika DNA-avsnitt har vanligen högre smälttemperatur än AT-rika avsnitt, men temperatur, jonstyrka, molekyllängd och sekvensfördelning påverkar också denatureringen.

B-DNA är den dominerande formen under fysiologiska förhållanden. Helixen är högervriden, cirka 2 nm i diameter och har en axiell stigning på ungefär 0,34 nm per baspar. Ett helixvarv omfattar cirka 10,5 baspar och mäter därmed omkring 3,6 nm längs helixaxeln. Basernas geometri skapar en bredare major groove och en smalare minor groove. I major groove exponeras ett mer informationsrikt mönster av vätebindningsdonatorer, acceptorer och hydrofoba grupper, varför många sekvensspecifika transkriptionsfaktorer känner igen DNA där. Andra proteiner, liksom vissa läkemedel och antibiotika, binder i minor groove.

Konformationsövergångar är lokala och dynamiska. Uttorkning gynnar A-formen, medan hög negativ supercoiling kan göra det energetiskt gynnsamt för vissa sekvenser att övergå från B- till Z-DNA. Polymeraser, nukleosomer och topoisomeraser påverkar därför inte bara DNA:s position utan även dess lokala struktur.

Det humana genomet och kromosomernas grundorganisation

Det haploida humana kärngenomet omfattar cirka 3,2 miljarder baspar, fördelade på 22 autosomer och en könskromosom. En normal diploid somatisk cell har vanligen 46 kromosomer: 22 homologa autosompar och två könskromosomer. DNA-mängden är då omkring 6,4 miljarder baspar i G1. Undantag finns bland annat i aneuploida tumörceller, polyploida hepatocyter och mogna erytrocyter, vilka saknar cellkärna.

En homolog kromosom är den maternella respektive paternella versionen av samma kromosomtyp. En kromatid är en sammanhängande DNA-dubbelhelix med associerat kromatin. Efter replikation består varje kromosom av två systerkromatider som hålls samman, särskilt kring centromeren. Centromeren är den kromosomregion där kinetokoren byggs; kinetokoren är ett multiproteinkomplex som binder mikrotubuli och överför krafter under kromosomsegregationen. Telomererna utgör kromosomändarnas repetitiva DNA–proteinkomplex och motverkar att naturliga ändar feltolkas som dubbelsträngsbrott.

En replikationsorigin är ett område där replikationsmaskineriet initierar DNA-syntes. Det humana genomet har många origins, men deras användning varierar mellan celltyper och cellcykler. En gen omfattar den transkriberade enheten och kan ge upphov till protein eller funktionellt RNA; dess uttryck påverkas av promotorer, enhancerregioner, insulatorer och andra regulatoriska element. Repetitivt DNA omfattar bland annat transposonhärledda sekvenser, tandemrepetitioner och satellit-DNA. Det är inte enbart strukturell utfyllnad utan bidrar till centromerfunktion, kromatinorganisation och evolution, samtidigt som felaktig rekombination mellan repetitioner kan orsaka rearrangemang.

Kromosomantal räknas efter antalet centromerer, inte efter DNA-massans storlek. Därför har en G2-cell fortfarande 46 kromosomer trots dubblerat DNA-innehåll. Mitokondrien utgör ett separat genetiskt system: humant mitokondriellt DNA är en cirkulär molekyl på 16 569 baspar, förekommer i flera kopior per mitokondrie och organiseras i nukleoider snarare än i kanoniska nukleosomer.

Kromatinets beståndsdelar och nukleosomens uppbyggnad

Kromatin består av DNA, histoner, talrika icke-histonproteiner och kromatinassocierade RNA-molekyler. Den grundläggande repetitiva enheten är nukleosomen. Histonoktamerens centrala struktur byggs först av en tetramer med två H3–H4-dimerer och kompletteras av två H2A–H2B-dimerer. Histonerna innehåller ett konserverat histonveckmotiv av α-helixar och förbindande slingor som möjliggör specifik histon–histonbindning.

Omkring 147 baspar DNA lindas i cirka 1,65 vänstervridna superhelikala varv kring oktameren. DNA och histoner hålls huvudsakligen samman genom elektrostatiska kontakter mellan den negativt laddade fosfatryggraden och positivt laddade lysin- och argininrester. Kontakterna är i stor utsträckning oberoende av bassekvens, vilket krävs för generell genompackning. Den färdiga nukleosomen är ungefär 11 nm i diameter och 5–6 nm hög.

Den isolerade oktameren med sina cirka 147 baspar DNA kallas nukleosomkärnpartikel. I kromatin används termen nukleosom ofta bredare och inkluderar även anslutande linker-DNA, vanligen omkring 20–60 baspar men med celltypsberoende variation. Linkerhistonen H1 binder nära DNA:s in- och utträde och stabiliserar en ytterligare DNA-sträcka; den H1-innehållande enheten benämns kromatosom. Histonernas flexibla N-terminala svansar skjuter ut från kärnpartikeln och fungerar som ytor för modifieringar och kontakter mellan nukleosomer.

Nukleosompositioneringen är inte slumpmässig. DNA måste böjas kraftigt, och sekvenser som med cirka 10 baspars periodicitet placerar böjliga motiv i riktning mot histonytan kan gynna en viss rotationsposition. ATP-beroende remodelerare och DNA-bindande proteiner har dock ofta större betydelse in vivo än sekvensen ensam. Histonvarianter specialiserar strukturen: H2A.Z är vanligt vid regulatoriska regioner, H2AX fosforyleras vid DNA-skada, CENP-A ersätter H3 i centromernukleosomer och specificerar kinetokorområdet, medan H3.3 deponeras replikationsoberoende i bland annat transkriptionsaktivt kromatin.

Nukleosomdeposition, histonomsättning och kromatinremodellering

Fria histoner är starkt basiska och skulle utan kontroll kunna aggregera med DNA och RNA. Histonchaperoner binder därför histoner, skärmar deras laddningar och levererar dem till rätt plats. ASF1 hanterar framför allt H3–H4 och deltar både vid replikation och reparation. CAF-1 kopplar deposition av H3–H4 till replikationsmaskineriet, medan NAP1 huvudsakligen hanterar H2A–H2B-dimerer. Efter deposition av H3–H4 byggs nukleosomen färdig genom tillägg av två H2A–H2B-dimerer.

När replikationsgaffeln passerar måste framförvarande nukleosomer tillfälligt demonteras. Föräldrahistoner återvinns till båda dottersträngarna och blandas med nybildade histoner. Därmed späds föräldranukleosomernas modifieringar ut, men de kan rekrytera enzymer som återställer liknande märken på närliggande nya histoner. Epigenetisk kontinuitet är alltså en aktiv rekonstruktionsprocess, inte enkel kopiering av en oförändrad kromatinstruktur.

ATP-beroende remodelerare omvandlar kemisk energi till rörelse eller deformation av nukleosomer. SWI/SNF-komplex kan glida eller avlägsna nukleosomer och öka tillgängligheten vid regulatoriska element. ISWI-komplex bidrar ofta till regelbundet nukleosomavstånd, CHD-familjen har roller i både aktiva och repressiva miljöer och INO80-familjen kan byta histonvarianter samt omstrukturera kromatin vid replikation och DNA-skada.

Under transkriptionselongering utgör nukleosomen ett mekaniskt hinder för RNA-polymeras II. FACT-komplexet hanterar tillfälligt H2A–H2B-dimerer och underlättar polymeraspassage utan att hela nukleosomen nödvändigtvis avlägsnas. Efter passagen återmonteras kromatinet, vilket begränsar felaktig initiering inne i genkroppen och minskar exponeringen av DNA.

Från nukleosomkedja till högre ordningens kromatin

Naket B-DNA har cirka 2 nm diameter. Lindning kring histoner förkortar polymerens effektiva längd och ger en oregelbunden nukleosomkedja med ungefär 10–11 nm tvärdimension. I cellkärnan bildar denna inte en enda lång fiber, utan lokala nukleosomkluster, sammanflätade polymersegment, slingor och domäner. En diploid human cell innehåller sammanlagt omkring två meter DNA, trots att cellkärnans diameter endast är några mikrometer.

Historiskt föreslogs ett ytterligare regelbundet packningssteg, 30 nm-fibern. Solenoidmodellen beskriver en enstartshelix där intilliggande nukleosomer följer varandra runt en gemensam axel. Tvåstarts- eller zigzagmodellen innebär i stället att nukleosomer alternerar mellan två staplar och förenas av relativt raka linkersegment. Båda strukturerna kan bildas i rekonstituerade nukleosomarrayer.

En enhetlig 30 nm-fiber betraktas emellertid inte som den generella strukturen i levande celler. Kryoelektrontomografi och superupplösningsmikroskopi visar framför allt heterogena nukleosomarrangemang utan genomgående 30 nm-periodicitet. Regelbundna fibrer kan främjas experimentellt av hög nukleosomtäthet, särskild linkerlängd, H1, magnesium och andra katjoner samt multivalenta kontakter mellan histonsvansar.

Detta är en viktig metodologisk reservation: isolering, fixering och förändrad jonmiljö kan skapa eller stabilisera strukturer som är ovanliga in vivo. Högre ordningens kompaktering bör därför beskrivas som dynamiska kluster och slingor snarare än som en obligatorisk serie av geometriskt definierade fibrer. I mitos organiseras slingorna längs en kromosomaxel och ger den robusta stavform som krävs för segregation.

Eukromatin, heterokromatin och funktionella kromatintillstånd

Eukromatin är relativt tillgängligt, ofta genrikt och tenderar att replikeras tidigt i S-fasen. Aktiva promotorer är vanligen anrikade på H3K4me3 och aktiva enhancerregioner på H3K27ac. Tillgänglighet innebär inte frånvaro av nukleosomer; även aktiva genkroppar är nukleosombundna, men nukleosomernas position, modifieringar och omsättningshastighet skiljer sig från dem i stabilt repressiva domäner.

Konstitutivt heterokromatin är långvarigt kompakterat, repetitivt och genfattigt. Pericentromeriska satelliter och delar av telomerregionerna är typiska exempel. H3K9me3 känns igen av HP1-proteiner, som genom multivalenta interaktioner främjar lokal kompaktering och begränsar rekombination och transposonaktivitet. Centromerens kärna är samtidigt ett specialfall: dess identitet bestäms av CENP-A-kromatin och kinetokorproteiner, inte enbart av generell H3K9me3-markering.

Fakultativt heterokromatin omfattar regioner som är tystade i vissa celltyper eller utvecklingsstadier men aktiva i andra. H3K27me3 deponeras av Polycomb repressive complex 2, vars katalytiska subenhet är EZH2. Det inaktiverade X-kromosomet är ett framträdande exempel och organiseras av lncRNA:t Xist tillsammans med flera repressiva komplex.

Klassifikationen är inte binär. Kompaktering, histonomsättning, tillgänglighet och transkriptionsaktivitet varierar kontinuerligt och behöver inte förändras parallellt. En region kan exempelvis vara tillgänglig men tillfälligt transkriptionsinaktiv, eller bära både aktiverande och repressiva markörer.

Kromatinslingor, loop extrusion och topologiskt associerande domäner

Cohesin är ett ringformat SMC-proteinkomplex som laddas på kromatin och kan skapa växande slingor genom loop extrusion. I den förenklade modellen fångar komplexet DNA och förflyttar kontaktpunkterna så att allt mer DNA dras in i slingan. Slingan är övergående och försvinner när cohesin dissocierar eller omlokaliseras.

CTCF binder sekvensspecifikt till orienterade motiv och kan fungera som barriär mot extrusion. Många starka slingankare innehåller två CTCF-motiv i konvergent orientering. Cohesin stoppas då från motsatta riktningar, vilket ökar sannolikheten för kontakt mellan ankarsätena. CTCF är dock inte en absolut vägg; både bindning och extrusion är dynamiska.

Topologiskt associerande domäner, TAD, är genomområden där interna kontakter i populationsbaserade kontaktkartor är vanligare än kontakter över domängränsen. De ligger ofta i storleksordningen hundratals kilobaspar till omkring en megabas. Gränser kan begränsa vilka promotorer en enhancer når och minskar därmed risken för reglering av fel gen.

Deletion av en gräns kan låta en enhancer aktivera en gen i grannområdet, så kallad enhancer hijacking. Inversion kan ändra CTCF-motivens orientering, och duplicering kan skapa nya kontaktområden. Sådana strukturella varianter kan ge missbildningssyndrom eller cancer trots att samtliga kodande exoner är intakta.

Kromosomterritorier, A/B-kompartment och kärnans arkitektur

Under interfas upptar varje kromosom ett delvis avgränsat kromosomterritorium. Territorierna är inte ogenomträngliga: ytor och slingor från olika kromosomer kan mötas, men kontakter inom samma kromosom är generellt vanligare. Genrika kromosomer och aktiva regioner ligger ofta mer centralt, medan genfattigt heterokromatin anrikas vid kärnperiferin och kring nukleolen.

Hi-C-data delar på stor skala in genomet i A- och B-kompartment. A-kompartmentet är i genomsnitt genrikt, transkriptionsaktivt och associerat med öppna kromatinmärken. B-kompartmentet är mer repressivt och samverkar ofta med kärnlamina eller nukleolära miljöer. Klassifikationen beskriver statistiska kontaktpreferenser: A-regioner kontaktar andra A-regioner oftare än förväntat, och motsvarande gäller B-regioner.

Lamina-associerade domäner, LAD, är ungefär 0,1–10 Mb stora och ofta genfattiga, sent replikerande och anrikade på repressiva histonmärken. Nukleolassocierade domäner har liknande drag men lokaliseras till nukleolens periferi. Aktiva gener kan i stället samlas i transkriptionshubbar med hög lokal koncentration av RNA-polymeras, Mediator och transkriptionsfaktorer.

Dessa mönster är sannolikhetsfördelningar, inte en statisk karta. Två sekvenser som ger en stark kontakt i populations-Hi-C behöver inte vara förenade i varje enskild cell. Kompartmenttillhörighet och radial position kan förändras under differentiering, signalering och cellcykel.

Organisation genom cellcykeln

I G1 är kromosomerna oreplicerade och organiserade i interfasdomäner. Under S-fasen aktiveras replikationsorigins enligt ett tidsprogram. Framför replikationsgaffeln demonteras nukleosomer partiellt, DNA syntetiseras, och bakom gaffeln återmonteras kromatin av chaperoner och remodelerare. Föräldrahistoner fördelas till dottermolekylerna och kompletteras med nya histoner.

Efter avslutad S-fas innehåller G2-cellen 46 kromosomer men 92 kromatider och cirka 4C DNA. Cohesin håller systerkromatiderna samman. Inför mitosen reorganiserar condensin II och därefter condensin I kromatinet till axiellt ordnade slingor. Topoisomeras II löser catenaner mellan systermolekylerna, medan H3S10-fosforylering korrelerar med mitotisk kromosomkondensation.

Vid metafas binder kinetokorerna mikrotubuli från motsatta spolpoler. Efter korrekt biorientering klyvs cohesin, och systerkromatiderna separeras i anafas. Kvarstående catenaner eller felaktiga kinetokorbindningar ger anafasbryggor, kromosombrott eller aneuploidi. Centromerens CENP-A-kromatin är avgörande för att kinetokoren ska bildas på rätt plats.

Transkriptionen avstannar huvudsakligen under mitos, men vissa transkriptionsfaktorer och histonmärken kvarstår som mitotisk bookmarking. När kärnmembranet återbildas etableras kromosomterritorier, TAD-liknande organisation och transkriptionsprogram på nytt. Bookmarking kan påskynda återaktivering, men den postmitotiska arkitekturen är en rekonstruerad struktur snarare än en helt oförändrad kopia av modercellens interfasorganisation.

Kromatin som regulator av transkription

Transkriptionsaktivering börjar ofta med att pionjärfaktorer känner igen sina motiv även när DNA är nukleosombundet. Deras bindning kan destabilisera lokala histon–DNA-kontakter och rekrytera SWI/SNF- eller andra remodelerare. Därefter kan histonacetyltransferaser deponera acetylmärken, vilka känns igen av bromodomänproteiner och andra coaktivatorer.

Aktiva promotorer och enhancerregioner innehåller ofta nukleosomfria eller nukleosomfattiga kärnområden flankerade av positionerade nukleosomer. Mediator överför signaler från enhancerbundna faktorer till det basala transkriptionsmaskineriet, varefter RNA-polymeras II initierar och går över i elongering. FACT och andra chaperoner hanterar nukleosomer under polymeraspassagen.

Öppet kromatin omfattar endast en mindre del av genomet — i storleksordningen några procent — men innehåller merparten av den sekvensspecifika transkriptionsfaktorbindningen. Enhancer–promotor-kontakter ökar den lokala sannolikheten för produktiv initiering. Insulatorer och TAD-gränser begränsar olämpliga kontakter, medan super-enhancers utgör kluster av starka regulatoriska element med hög ansamling av exempelvis Mediator och BRD4.

Transkription sker ofta i utbrott: en promotor växlar mellan perioder med hög initieringssannolikhet och perioder av inaktivitet. Kromatinomsättning, faktorbindning och enhancerkommunikation påverkar både utbrottens frekvens och storlek. Att öppet kromatin korrelerar med RNA-uttryck bevisar dock inte att öppenheten orsakar uttrycket; transkriptionsfaktorer eller pågående transkription kan själva öppna kromatinet, och båda variablerna kan styras av en tredje signalväg.

Epigenetiska modifieringar av histoner, DNA och RNA

Histonmodifieringar hanteras funktionellt av writers, erasers och readers. Writers överför kemiska grupper, erasers tar bort dem och readers binder den modifierade aminosyran för att rekrytera effektorkomplex. Modifieringarna sitter ofta på utskjutande histonsvansar men förekommer även i den globulära histonkärnan.

H3K4me3 är typiskt för aktiva promotorer, H3K27ac för aktiva enhancerregioner och promotorer och H3K36me3 för transkriberade genkroppar. H3K9me3–HP1 karakteriserar många konstitutivt repressiva domäner, medan H3K27me3–Polycomb är vanligt vid fakultativ repression. Samma markör kan dock ha olika konsekvens beroende på genomiskt läge, kombinationen av andra märken och vilka readerproteiner som finns i cellen.

DNA-metylering sker i däggdjur främst på cytosin i CpG-dinukleotider. DNMT3A och DNMT3B etablerar de novo-metylering, medan DNMT1 företrädesvis metylerar den nybildade strängen vid hemimetylerade CpG efter replikation. Promotornära CpG-metylering kan blockera faktorbindning och rekrytera metyl-CpG-bindande proteiner. TET1–3 oxiderar 5-metylcytosin till bland annat 5-hydroximetylcytosin och vidare produkter som kan återföras till ometylerat cytosin via DNA-reparationsprocesser.

RNA bidrar också strukturellt. Xist sprids över det X-kromosom som ska inaktiveras och rekryterar repressiva faktorer, inklusive Polycombrelaterade system. Andra lncRNA kan fungera som guider eller ställningar. Begreppet ”histonkod” får inte tolkas som ett entydigt instruktionsspråk: märkena är kontextberoende signaler, stabilitetsfaktorer och rekryteringsytor, inte deterministiska kommandon.

DNA-topologi, supercoiling och genomets mekaniska problem

För en topologiskt sluten DNA-domän gäller sambandet Lk = Tw + Wr. Linking number, Lk, anger hur många gånger strängarna är sammanlänkade; twist, Tw, beskriver dubbelhelixens lokala vridning; writhe, Wr, beskriver hur helixaxeln slingrar sig i rummet. Om Lk inte kan ändras måste förändring av twist kompenseras av writhe eller omvänt.

När DNA binds kring histonoktamerer introduceras negativt writhe. Transkriberande och replikerande polymeraser genererar samtidigt positiv supercoiling framför komplexet och negativ supercoiling bakom det. Proteinförankringar, loopar och domängränser begränsar torsionsspänningens spridning. Utan relaxation kan helixen bli svår att öppna, replikationsgafflar stanna och alternativa DNA-konformationer uppstå.

Typ I-topoisomeraser gör ett övergående enkelsträngsbrott och låter DNA rotera eller en sträng passera. Typ II-topoisomeraser gör ett övergående dubbelsträngsbrott och för en annan dubbelsträng genom öppningen; processen kräver ATP. TOP2A är särskilt viktig för decatenering av replikerade systerkromatider före och under mitos.

Topoisomerashämmare utnyttjas kliniskt i cancerbehandling. Topoisomeras I-hämmare, exempelvis irinotekan och topotekan, stabiliserar klyvningskomplex så att enkelsträngsbrott omvandlas till allvarligare skador vid replikation. Etoposid och antracykliner påverkar topoisomeras II-komplex och kan ge dubbelsträngsbrott. Kvarstående catenaner och knutar orsakar anafasbryggor, felaktig segregation, kromosomfragmentering och aneuploidi.

Kromatin vid DNA-skada, reparation och genomstabilitet

DNA-skada registreras och repareras i kromatin, inte på naket DNA. PARP1 binder snabbt till DNA-brott och syntetiserar poly(ADP-ribos), vilket skapar negativt laddade rekryteringsytor och bidrar till lokal kromatinrelaxation. Remodelerare och chaperoner flyttar eller avlägsnar därefter nukleosomer så att skadan blir åtkomlig.

Vid dubbelsträngsbrott fosforyleras histonvarianten H2AX på serin 139 till γH2AX. Signalen kan spridas över megabasstora områden kring brottet och organiserar rekrytering av reparations- och checkpointproteiner. γH2AX används kliniskt och experimentellt som markör för DNA-skaderespons, men ett fokus anger en signaleringsdomän snarare än brottets exakta position.

Basexcisionreparation avlägsnar små basförändringar och abasiska läsioner, medan nukleotidexcisionreparation avlägsnar större helixdistorderande skador såsom UV-inducerade fotoprodukter. Båda kräver lokal åtkomst mellan eller genom nukleosomer. Reparation i heterokromatin är ofta långsammare och kräver särskild omstrukturering.

Vid dubbelsträngsbrott konkurrerar huvudsakligen icke-homolog sammanfogning, NHEJ, och homolog rekombination, HR. 53BP1–RIF1–shieldin skyddar DNA-ändarna från omfattande resektion och gynnar NHEJ, som är tillgänglig under större delen av cellcykeln men kan ge små insertioner eller deletioner. BRCA1 och resektion av 5′-ändarna skapar 3′-överhäng och gynnar HR. HR används främst i S- och G2-fas, när en systerkromatid finns som mall, och är central för högfidelitetsreparation.

Specialiserad genompackning, sjukdomsmekanismer och undersökningsmetoder

Spermiernas kromatin skiljer sig markant från somatiskt kromatin. Under spermiogenesen ersätts merparten av histonerna med små argininrika protaminer, vilket ger mycket stark kondensation och begränsad transkription. Mitokondriellt DNA packas med bland annat TFAM i nukleoider och saknar kanoniska histonoktamerer. Många arkéer använder histonlika proteiner som kan bilda nukleosomliknande aggregat av varierande längd, medan bakteriers nukleoid organiseras genom supercoiling och proteiner såsom HU och H-NS.

Mutationer i kromatinregulatorer kan vara primära sjukdomsdrivare. Cohesin- eller CTCF-rubbningar förändrar loopar och genreglering och förekommer vid utvecklingssyndrom och cancer. Förlust av SWI/SNF-subenheter kan göra repressiva Polycombprogram dominerande. DNMT3A- och TET2-mutationer är vanliga vid klonal hematopoes och myeloiska maligniteter, medan EZH2 kan vara aktiverat eller inaktiverat beroende på tumörtyp. Histonmutationer kan omprogrammera modifieringslandskapet, och mutationer i laminproteiner orsakar laminopatier med vävnadsspecifik påverkan trots laminernas generella kärnfunktion.

MNase-seq kan lokalisera positionerade nukleosomer, medan ATAC-seq kartlägger tillgängliga promotorer och enhancerregioner. ChIP-seq och de ofta mer låginput-anpassade metoderna CUT&RUN och CUT&Tag kartlägger specifika proteiner eller histonmärken. Resultaten måste bedömas mot kontroller, antikroppsval och sekvenseringsdjup; breda repressiva domäner kräver annan analys än smala transkriptionsfaktortoppar.

Hi-C infererar kontaktfrekvenser från fixering, klyvning och närhetsligering. Upplösningen bestäms inte enbart av restriktionsfragmentens storlek utan också av antalet informativa läspar; kartor på kilobasskala kräver mycket djup sekvensering. Populations-Hi-C medelvärdesbildar många celler och kan därför visa en stark TAD även om de underliggande slingorna är övergående och varierar mellan cellerna.

Superupplösningsmetoder kan nå tiotals nanometers skala och visa kromatinkluster som döljs av konventionell ljusmikroskopis cirka 200 nm stora upplösningsgräns. De ger dock inte automatiskt sekvensidentitet eller funktion. Ingen enskild metod kan bevisa att en observerad kontakt aktiverar en gen; robust kausalitet kräver vanligen genetisk eller epigenetisk perturbation av ankare, enhancer, gräns eller regulatorprotein i kombination med struktur- och uttrycksmätning.

Källor

• Chromatin
• Kromatin
• Category:Chromatin
• Chromatin
• Bild: File:Chromatin and histones.jpg — Darryl Leja, NHGRI, Public domain
• Bild: File:Chromatin and chromatin with nucleosome eviction.jpg — MethylC5, CC0
• Bild: File:Acheiropodia Chromatin Architecture (TAD).jpg — Biomarker1989, CC BY-SA 4.0