Odlings-, färgnings- och identifieringsmetoder

Gramfärgning, odling och biokemisk identifiering utgör ett sammanhängande diagnostiskt arbetsflöde där mikroskopisk fenotyp styr val av medier och inkubationsmiljö, varefter renkultur vanligen krävs för säker fenotypisk artbestämning. Resultatens kliniska värde avgörs i lika hög grad av korrekt provtagning, transport, kvalitetssäkring och kännedom om metodernas felkällor som av själva analysreaktionen.

Preanalytik: provtagning, transport och direktmikroskopi

Mikrobiologisk diagnostik börjar med att provet tas från rätt anatomisk lokal och faktiskt representerar infektionshärden. Aspirat, vävnadsbiopsi och prov från normalt steril vätska har i regel högre diagnostiskt värde än ytliga pinnprov. Ett sårprov från nekrotisk yta kan huvudsakligen återge koloniserande hud- och miljöflora, medan aspirat från abscessens djup bättre speglar etiologin. Provtagning genom områden med normalflora, exempelvis munhåla, vagina eller hud, medför risk för kontamination och kräver att fynden värderas mot provtyp, mängd och inflammationsbild.

Prov bör om möjligt tas före första antibiotikados. Antimikrobiell behandling kan snabbt minska antalet odlingsbara bakterier utan att inflammationen eller mängden mikrobiellt DNA minskar i motsvarande grad. Om behandlingen redan har inletts tas provet lämpligen strax före nästa dos och laboratoriet informeras om preparat, dosering och behandlingstid. Otillräcklig provvolym, uttorkning, temperaturavvikelse och lång transporttid kan ge falskt negativ odling, medan fördröjd transport av exempelvis urin kan ge bakteriell tillväxt och falskt förhöjt kolonital.

Blododlingens känslighet är starkt volymberoende eftersom bakteriemin vid sepsis kan vara låggradig. Hos vuxna eftersträvas därför normalt flera flaskor med sammanlagd blodvolym enligt lokal rutin; överfyllnad kan däremot störa förhållandet mellan blod och buljong och öka risken för instrumentlarm. Hos barn anpassas volymen till kroppsvikt och cirkulerande blodvolym. Huddesinfektion och aseptisk teknik är avgörande för att minska fynd av koagulasnegativa stafylokocker, corynebakterier och andra hudorganismer.

Låg mikrobiell koncentration kan kompenseras genom koncentrering. Likvor och andra sterila vätskor kan centrifugeras, varefter sedimentet används för mikroskopi och odling. Större vätskevolymer kan membranfiltreras, ofta genom filter med cirka 0,45 µm porstorlek, varefter filtret odlas. Metoderna ökar utbytet men koncentrerar även kontaminanter och måste utföras aseptiskt.

Direktmikroskopi ger ett svar innan kolonier hunnit växa. Grampositiva kocker i klasar i blododlingsflaska talar exempelvis för stafylokocker, medan grampositiva kocker i kedjor eller par för tanken mot streptokocker eller enterokocker. Gramnegativa stavar i likvor eller blod kan motivera omedelbar anpassning av empirisk behandling. Leukocyter stödjer en inflammatorisk process, medan rikligt med skivepitelceller i sputum talar för salivkontamination. Mikroskopin styr samtidigt om anaeroba, selektiva, svamp- eller mykobakteriemedier behöver läggas till.

Gramfärgning: kemisk och strukturell princip

Gramfärgning är en differentiell färgning som avspeglar bakteriehöljets förmåga att behålla ett kristallviolett–jod-komplex under avfärgning. Ett tunt utstryk görs på ett rent objektglas, lufttorkas och fixeras. Fixering kan ske med kontrollerad värme eller metanol och syftar till att fästa cellerna, avdöda de flesta organismer och bevara morfologin. Kraftig upphettning förvränger däremot celler och kan orsaka färgningsartefakter.

Först täcks preparatet med kristallviolett, ett basiskt färgämne som penetrerar både grampositiva och gramnegativa bakterier. Därefter tillsätts jodlösning. Jod fungerar som mordant genom att bilda större, mindre lösliga komplex med kristallviolett inne i cellen. Vid denna punkt är båda huvudgrupperna violetta.

Det kritiska momentet är avfärgning med alkohol, aceton eller en blandning av dessa. I grampositiva bakterier dehydrerar alkoholen det tjocka, flerskiktade peptidoglykanet och minskar dess porositet. Kristallviolett–jod-komplexet hålls därför kvar. Gramnegativa bakteriers lipidrika yttre membran löses samtidigt upp, och det tunna peptidoglykanlagret kan inte behålla komplexet; cellerna blir färglösa.

Slutligen används en kontrastfärg, vanligen safranin. Avfärgade gramnegativa bakterier färgas rosa till röda, medan grampositiva bakterier förblir mörkt violetta eftersom den starka primärfärgen maskerar kontrastfärgen. Resultatet är således inte ett direkt mått på mängden peptidoglykan, utan på cellhöljets samlade reaktion under den standardiserade avfärgningen.

Tolkning och felkällor vid Gramfärgning

Rapporteringen ska vara systematisk och kopplad till provtypen. Först anges gramreaktion, därefter morfologi och arrangemang: kocker, stavar, kockoida stavar eller böjda former; par, kedjor, klasar eller palissader. Storleksvariation, pleomorfism, sporer och jästliknande celler noteras. I kliniska direktpreparat bedöms även mängden leukocyter, skivepitelceller och mikroorganismer, helst semikvantitativt enligt laboratoriets standard.

Överavfärgning gör grampositiva celler falskt rosa, medan underavfärgning gör gramnegativa celler falskt violetta. Ett för tjockt utstryk hindrar jämn penetration och avfärgning. Gamla kulturer kan bli gramvariabla när cellväggen bryts ned; samma fenomen ses efter exponering för cellväggsaktiva antibiotika. För kraftig fixering, uttorkade reagens, färgfällningar och cellrester kan misstolkas som bakterier. Kontrollpreparat med kända grampositiva och gramnegativa organismer bör därför färgas regelbundet.

Vissa organismer kan inte bedömas tillförlitligt med Gramfärgning. Mykobakteriers mykolsyrarika cellvägg kräver syrafast färgning. Mykoplasma saknar cellvägg, spiroketer är för tunna för säker rutinmässig ljusmikroskopi och obligat intracellulära bakterier förekommer ofta i låg mängd eller färgas svagt. De kan därför ge negativ Gramfärgning trots infektion.

Fynd i normalt sterila prov har omedelbar klinisk betydelse. Bakterier i likvor, pleuravätska eller ledvätska ska skyndsamt kommuniceras, eftersom morfologin kan påverka antibiotikaval och behov av smittskyddsåtgärder. Ett negativt direktpreparat utesluter dock inte infektion, särskilt inte vid låg bakteriemängd, liten provvolym eller föregående antibiotikabehandling.

Specialfärgningar och kompletterande mikroskopi

Specialfärgningar används när målorganismen eller den diagnostiskt relevanta strukturen inte framträder med Gramfärgning. Resultatet ska alltid bedömas tillsammans med positiv kontroll, negativ kontroll och preparatets bakgrund. Kontrollerna visar både att reagensen fungerar och att avfärgning och mikroskopinställning är adekvata.

Syrafast mikroskopi har begränsad analytisk känslighet och ett negativt preparat utesluter inte tuberkulos. Ett positivt preparat visar syrafasta organismer men skiljer inte säkert Mycobacterium tuberculosis-komplexet från andra mykobakterier. Artbestämning och resistensbedömning kräver därför nukleinsyraanalys, odling eller båda.

Direkt och indirekt immunfluorescens använder fluorescensmärkta antikroppar mot specifika mikrobiella antigen. Metoden kan ge snabbt resultat för svårodlade organismer men påverkas av antikropparnas specificitet, antigenvariation och provets cellhalt. Positiv kontroll med känt antigen och negativ kontroll utan primärantikropp eller med irrelevant antikropp behövs för att avslöja reagensfel och ospecifik fluorescens.

Odlingsmediets uppbyggnad och klassifikation

Ett odlingsmedium måste tillföra kol för energi och biosyntes, kväve för aminosyror och nukleotider samt salter för osmotisk balans och enzymfunktion. Buffertar stabiliserar pH när organismen producerar syror eller alkaliska metaboliter. Krävande bakterier behöver tillskott av exempelvis blod, hemin, NAD, vitaminer eller aminosyror. Agar är vanligen ett inert geleringsmedel som smälter vid hög temperatur men förblir fast vid rutinmässig inkubation.

Indikatorer, exempelvis pH-färgämnen, omvandlar metabolism till synliga färgförändringar. Inhibitorer kan utgöras av gallsalter, hög salthalt, färgämnen eller antibiotika. Ett medium kan vara både selektivt och differentiellt: MacConkeyagar hämmar många grampositiva bakterier samtidigt som laktosfermentation visualiseras.

Kliniskt viktiga medier och deras reaktioner

Blodagar är ett berikat och differentiellt medium. Fullständig hemolys med klar zon benämns betahemolys, partiell hemoglobinomvandling med grönaktig zon alfahemolys och avsaknad av synlig hemolys gammahemolys. Chokladagar framställs genom lysering av blodceller, vilket frigör bland annat hemin och NAD och stödjer krävande bakterier såsom Haemophilus och Neisseria. Benämningen avser färgen, inte tillsats av choklad.

På XLD-agar fermenterar många enteriska bakterier xylose och bildar syra, vilket ger gula kolonier eller gul omgivning via pH-indikatorn fenolrött. *Salmon