Purin- och pyrimidinsyntes

Purin- och pyrimidinnukleotider bildas dels genom energikrävande de novo-syntes, dels genom återvinning, så kallad salvage, av baser eller nukleosider. Vägarna skiljer sig principiellt: purinringen byggs direkt på en aktiverad ribos, medan pyrimidinringen färdigställs innan den kopplas till ribosfosfat. En strikt reglering krävs för att ge tillräckliga men balanserade ribo- och deoxyribonukleotidpooler; störningar orsakar bland annat hyperurikemi, immunbrist, neurologisk sjukdom och replikationsstress.

Grundbegrepp: bas, nukleosid och nukleotid

Puriner består av en sexledad ring fusionerad med en femledad ring. De två purinbaserna i nukleinsyror är adenin och guanin. Pyrimidiner har en enkel sexledad heterocyklisk ring; de biologiskt centrala pyrimidinbaserna är cytosin, uracil och tymin. DNA innehåller adenin, guanin, cytosin och tymin, medan RNA normalt innehåller uracil i stället för tymin.

En kvävebas som bundits med en β-N-glykosidbindning till ribos eller 2-deoxyribos utgör en nukleosid. Adenin ger således adenosin eller deoxyadenosin, guanin ger guanosin eller deoxyguanosin och uracil ger uridin eller deoxyuridin. Tyminnukleosiden i DNA benämns vanligen tymidin, det vill säga deoxytymidin. Fosforylering, i regel vid sockrets 5′-kol, ger en nukleotid.

Mono-, di- och trifosfaten betecknas exempelvis AMP, ADP och ATP respektive dAMP, dADP och dATP. Nukleotider är inte enbart monomerer i RNA och DNA. ATP och GTP driver energikrävande reaktioner, UTP aktiverar sockerarter och CTP används bland annat vid fosfolipidsyntes. Adeninnukleotider ingår i koenzymer som NAD, FAD och koenzym A, medan cAMP och cGMP fungerar som intracellulära signalmolekyler. Extracellulärt verkar ATP, ADP och adenosin dessutom via purinerga receptorer.

Metabola utgångsämnen och intracellulär organisation

Ribosdelen kommer huvudsakligen från ribos-5-fosfat, som bildas i pentosfosfatvägens oxidativa eller icke-oxidativa del. PRPP-syntetas överför därefter pyrofosfat från ATP till ribos-5-fosfat:

ribos-5-fosfat + ATP → 5-fosforibosyl-1-pyrofosfat (PRPP) + AMP

Eftersom ATP spjälkas till AMP förbrukas två energirika fosfoanhydridbindningar. PRPP är en aktiverad ribosdonator i både de novo-syntes och salvage. Hög tillgång på ribos-5-fosfat, ATP och oorganiskt fosfat kan därför öka nukleotidflödet, förutsatt att kväve- och enkolsdonatorer också finns tillgängliga.

Ringatomerna hämtas från glutamin, aspartat, glycin, bikarbonat och folatbundna enkolsfragment. Glutamin avger amidkväve, medan aspartat kan bidra med både kväve och kolstomme. Glycin införlivas nästan intakt i purinringen. N^10-formyltetrahydrofolat donerar två separata kolatomer till puriner, medan N^5,N^10-metylentetrahydrofolat behövs för tymidylatsyntesen.

De novo-syntesen sker huvudsakligen i cytosolen. Purinenzymer kan vid hög efterfrågan samlas i dynamiska purinosomer, vilket anses underlätta substratöverföring och samordning med mitokondrier och folatmetabolism. Pyrimidinvägens tre första aktiviteter finns i däggdjursceller i det multifunktionella cytosoliska CAD-proteinet: karbamoylfosfatsyntetas II, aspartattranskarbamylas och dihydroorotas. Undantaget från den cytosoliska lokaliseringen är dihydroorotatdehydrogenas, DHODH, som sitter i mitokondriens innermembran.

De novo-syntes av puriner: från PRPP till IMP

Vid purinsyntes byggs ringens atomer successivt på PRPP:s ribos. Den första engagerande reaktionen katalyseras av glutamin-PRPP-amidotransferas. Glutamins amidkväve ersätter pyrofosfatgruppen och ger 5-fosforibosylamin, PRA. Reaktionen är funktionellt irreversibel genom efterföljande pyrofosfathydrolys och utgör en central regleringspunkt.

GAR betyder glycinamidribonukleotid, FGAR formyl-GAR, FGAM formylglycinamidinribonukleotid och AIR aminoimidazolribonukleotid. Efter karboxylering och aspartattillsats bildas SAICAR. Adenylosuccinatlyas avlägsnar därefter aspartatets kolskelett som fumarat och lämnar aminogruppen i AICAR. En andra formylgrupp tillförs innan den sexledade ringen sluts och inosinmonofosfat, IMP, bildas.

Ringatomernas ursprung är exakt organiserat:

• N1: aspartat
• C2 och C8: N^10-formyl-THF
• N3 och N9: glutamin
• C4, C5 och N7: glycin
• C6: CO₂ eller HCO₃⁻

Från PRPP till IMP förbrukas fyra ATP till ADP. Om även bildningen av PRPP, där ATP går till AMP, inkluderas motsvarar syntesen sex energirika fosfatbindningar. Därtill krävs två glutamin, glycin, aspartat, bikarbonat och två formyl-THF. Kostnaden förklarar varför salvage är metabolt fördelaktig.

IMP som förgreningspunkt: syntes av AMP och GMP

IMP innehåller basen hypoxantin och är gemensam prekursor för AMP och GMP. I AMP-grenen adderar adenylosuccinatsyntetas aspartat till IMP. Reaktionen drivs av hydrolys av GTP till GDP och fosfat. Adenylosuccinatlyas avspjälkar därefter fumarat, medan aspartatets kväve behålls som AMP:s exocykliska aminogrupp.

GMP-grenen inleds med oxidation av IMP till xantosinmonofosfat, XMP, genom IMP-dehydrogenas. NAD⁺ reduceras till NADH. Därefter överför GMP-syntetas glutamins amidkväve till XMP. ATP spjälkas till AMP och pyrofosfat, vilket motsvarar två energirika fosfatbindningar.

Korskopplingen motverkar ensidig expansion av endera poolen: GTP driver AMP-bildning, medan ATP driver GMP-bildning. AMP och GMP fosforyleras till difosfat av specifika kinaser. Nukleosiddifosfatkinas överför sedan fosfat reversibelt mellan nukleosiddifosfat och nukleosidtrifosfat, exempelvis GDP + ATP ↔ GTP + ADP.

Reglering av purinsyntesen

PRPP-syntetas regleras av substrattillgång och allosteri. Oorganiskt fosfat stimulerar enzymaktiviteten, medan purinnukleosiddifosfat, framför allt ADP och GDP, hämmar flera humana isoformer. Isoformspecifika skillnader, proteininteraktioner och vävnadsuttryck påverkar regleringen. Aktiverande mutationer eller minskad feedbackkänslighet kan ge hög PRPP-produktion och sekundär purin- och uratöverproduktion.

Glutamin-PRPP-amidotransferas hämmas genom återkoppling av IMP, AMP och GMP. Kombinationer av slutprodukterna ger kraftigare inhibition än en enskild nukleotid. PRPP aktiverar däremot enzymet och stabiliserar en aktiv konformation. Ökad salvage förbrukar PRPP och höjer samtidigt AMP-, GMP- eller IMP-poolerna, vilket bromsar de novo-flödet genom två samverkande mekanismer.

Flödet begränsas också av tillgång på glutamin, glycin, aspartat och N^10-formyl-THF. Folatbrist eller folatantagonism hämmar de två transformyleringsstegen. Prolifererande celler ökar pentosfosfatflöde, enzymuttryck och purinosombildning genom bland annat tillväxtsignalering. Detta gör maligniteter och aktiverade lymfocyter särskilt känsliga för hämmare av purin- eller folatmetabolism.

Salvage och interkonversion av puriner

Purinsalvage kopplar fria baser direkt till PRPP. HGPRT, hypoxantin-guanin-fosforibosyltransferas, katalyserar:

• hypoxantin + PRPP → IMP + PPi
• guanin + PRPP → GMP + PPi

APRT, adenin-fosforibosyltransferas, katalyserar adenin + PRPP → AMP + PPi. Pyrofosfathydrolys driver reaktionerna framåt. Eftersom den färdiga purinringen återanvänds undviks huvuddelen av de novo-vägens energikostnad.

Adenosin kan fosforyleras direkt till AMP av adenosinkinas. Purinnukleosidfosforylas, PNP, katalyserar reversibel fosforolys av bland annat inosins och guanosins glykosidbindningar och bildar ribos-1-fosfat samt hypoxantin respektive guanin. Reaktionsriktningen beror på substratkoncentrationerna, men i mänsklig vävnad är enzymet viktigt för katabolism och för att tillgängliggöra baser för salvage.

AMP-deaminas omvandlar AMP till IMP och knyter adenylatpoolen till hypoxantin- och uratbildning. Adenylatkinas katalyserar 2 ADP ↔ ATP + AMP och buffrar cellens energiladdning. Nervvävnad och benmärg har stor nukleotidomsättning och betydande behov av salvage. Mogna erytrocyter saknar cellkärna och mitokondrier men måste upprätthålla adeninnukleotider för membran, jonpumpar och glykolys; de är därför beroende av extracellulära prekursorer och återvinningsreaktioner.

De novo-syntes av pyrimidiner: från karbamoylfosfat till UMP

Pyrimidinringen syntetiseras innan den kopplas till PRPP. Cytosoliskt karbamoylfosfatsyntetas II, CPS II, använder glutamin som kvävedonator och förbrukar två ATP:

glutamin + HCO₃⁻ + 2 ATP + H₂O → karbamoylfosfat + glutamat + 2 ADP + Pi

Karbamoylfosfat kondenseras med aspartat av aspartattranskarbamylas till karbamoylaspartat. Dihydroorotas katalyserar ringstängning till dihydroorotat. Dessa tre aktiviteter ingår i CAD-komplexet, vilket möjliggör samordnad reglering och begränsar diffusionen av intermediärer.

Dihydroorotat transporteras till mitokondriens innermembran och oxideras till orotat av dihydroorotatdehydrogenas, DHODH. Elektronerna överförs till ubikinon och vidare till andningskedjan. Pyrimidinsyntesen blir därmed indirekt beroende av fungerande mitokondriell elektrontransport, trots att övriga steg sker i cytosolen.

Orotat förenas därefter med PRPP av orotatfosforibosyltransferas och ger orotidinmonofosfat, OMP. OMP-dekarboxylas avlägsnar CO₂ och bildar UMP. Båda aktiviteterna finns i det bifunktionella proteinet UMP-syntas. Vid brist på detta enzym ansamlas orotat, eftersom pyrimidinringen har bildats men inte effektivt kan omvandlas till UMP.

Från UMP till UTP och CTP samt reglering av pyrimidinflödet

UMP fosforyleras av UMP/CMP-kinas till UDP, varefter nukleosiddifosfatkinas bildar UTP. CTP-syntetas aminerar UTP till CTP med glutamin som kvävedonator. ATP används för att aktivera uracilringens karbonylgrupp före ammoniakattack.

UTP hämmar CPS II genom återkoppling, medan PRPP signalerar tillgång på aktiverad ribos och stimulerar CAD. Mitogen signalering kan fosforylera CAD och öka pyrimidinproduktionen inför DNA-replikation. CTP hämmar CTP-syntetas och bidrar därmed till balansen mellan uridin- och cytidinnukleotider.

CPS II ska skiljas från mitokondriellt CPS I i ureacykeln. CPS I använder fri ammoniak, finns i leverns mitokondriematrix, aktiveras av N-acetylglutamat och levererar karbamoylfosfat till ureabildning. CPS II använder glutamin, finns i cytosoliskt CAD och regleras av pyrimidinnukleotider och PRPP.

Syntes av deoxyribonukleotider och tymidylat

Ribonukleotidreduktas, RNR, reducerar ADP, GDP, CDP och UDP till motsvarande dNDP. Reaktionen avlägsnar 2′-hydroxylgruppen från ribos och ersätter den med väte. Elektroner tillförs via tioredoxin eller glutaredoxin, vilka i sin tur regenereras med reducerande kraft från NADPH. Därefter bildar nukleosiddifosfatkinaser dNTP.

RNR har skilda allosteriska ställen för total aktivitet och substratspecificitet. ATP vid aktivitetsstället gynnar enzymaktivitet, medan högt dATP binder en inhibitorisk konformation och stänger av reduktionen. Vid specificitetsstället styr ATP/dATP, dTTP och dGTP vilket ribonukleotidsubstrat som reduceras. Den sekventiella regleringen håller dATP-, dGTP-, dCTP- och dTTP-poolerna tillräckligt jämna för korrekt DNA-syntes.

dUMP kan bildas genom defosforylering av dUDP eller genom deaminering av dCMP. Tymidylatsyntas överför en metylen- och reduktionsekvivalent från N^5,N^10-metylen-THF till dUMP och bildar dTMP. Folatet oxideras till dihydrofolat, som reduceras tillbaka till THF av dihydrofolatreduktas, DHFR, med NADPH. dUTPas hydrolyserar dUTP till dUMP och pyrofosfat; därigenom hålls dUTP lågt och uracilinkorporering i DNA motverkas.

Pyrimidinsalvage och nukleotidpoolernas homeostas

Humana celler återvinner främst pyrimidinnukleosider snarare än fria pyrimidinbaser. Uridin-cytidinkinaser fosforylerar uridin och cytidin till UMP respektive CMP. Deoxycytidinkinas har bred substratspecificitet och fosforylerar flera deoxynukleosider samt ett antal nukleosidanaloga läkemedel.

Tymidinkinas 1, TK1, är cytosoliskt och ökar under S-fas för att understödja DNA-replikation. Tymidinkinas 2, TK2, är mitokondriellt och bidrar till mitokondriell dTTP-försörjning även i icke-delande celler. Bristande mitokondriell salvage kan därför ge mtDNA-utarmning trots relativt bevarad cytosolisk nukleotidmetabolism.

ATP förekommer vanligen i millimolärt intracellulärt koncentrationsområde, medan dNTP-poolerna typiskt ligger från låg till tiotals mikromolar storleksordning. Nivåerna varierar betydligt mellan vävnader och cellcykelfaser. Både brist och inbördes obalans mellan dNTP kan bromsa replikationsgafflar, öka felinkorporering, försämra DNA-reparation och driva mutationer eller kromosominstabilitet.

Koppling till nedbrytning och utsöndring

Salvage konkurrerar med katabolismen om purinbaser och nukleosider. Adenosin omvandlas via inosinsystemet till hypoxantin, medan guanosin ger guanin och därefter xantin. Xantinoxidas/xantindehydrogenas oxiderar hypoxantin till xantin och xantin vidare till urat.

Människan saknar funktionellt urikas och kan därför inte oxidera urat vidare till det mer lättlösliga allantoinet. Mononatriumuratets löslighetsgräns i biologisk vätska är omkring 6,8 mg/dL, motsvarande cirka 405 µmol/L, vid fysiologiska förhållanden. Överskriden mättnad ökar förutsättningarna för kristallbildning, men giktutveckling påverkas också av temperatur, pH, lokala vävnadsförhållanden och kristallhantering.

Pyrimidinringar kan däremot öppnas och brytas ned till vattenlösliga produkter. Uracil och cytosin ger bland annat β-alanin, medan tymin ger β-aminoisobutyrat; dessutom bildas CO₂ och ammoniak. Hög PRPP-tillgång, svag purinsalvage eller stor cellomsättning ökar purinflödet och därmed uratproduktionen. Njurarnas och tarmens uratutsöndring avgör om produktionen resulterar i hyperurikemi.

Medfödda rubbningar i nukleotidsyntes och salvage

Defekter i purinsalvage ger både substratansamling och avsaknad av återkopplingshämning. Vid nästan fullständig HGPRT-brist, Lesch–Nyhans syndrom, förbrukas mindre PRPP i salvage och IMP/GMP-poolerna minskar. De novo-syntesen ökar, vilket ger hyperurikemi, uratstenar och giktliknande manifestationer. Neurologiskt ses dystoni, utvecklingsavvikelse och karakteristiskt självskadebeteende. Partiell HGPRT-brist ger Kelley–Seegmillers syndrom, där uratmanifestationer dominerar och neurologin är lindrigare eller saknas.

Vid ADA-brist ansamlas deoxyadenosin och dATP. Högt dATP hämmar RNR och stör lymfocyternas dNTP-balans, vilket kan ge svår kombinerad immunbrist. PNP-brist medför särskilt deoxyguanosin- och dGTP-ansamling och drabbar främst T-celler. APRT-brist ger den svårlösliga metaboliten 2,8-dihydroxiadenin, som kan orsaka recidiverande konkrement och njursvikt.

UMP-syntasbrist orsakar hereditär orotaciduri med kraftigt ökad orotatutsöndring, megaloblastisk anemi och tillväxtpåverkan utan primär hyperammonemi. CAD-brist kan ge utvecklingsneurologisk sjukdom, epilepsi och anemi. Uridinbehandling kringgår blockaden genom salvage till UMP. Viktig differentialdiagnos är ornitintranskarbamylasbrist, där mitokondriellt karbamoylfosfat läcker till pyrimidinvägen och ger sekundär orotaciduri tillsammans med hyperammonemi.

Farmakologiska angreppspunkter

Flera antimetaboliter hämmar enzymsteg som prolifererande celler är särskilt beroende av. Metotrexat hämmar främst DHFR och minskar regenereringen av THF. Därmed påverkas både tymidylat- och purinsyntes. Pemetrexed hämmar flera folatberoende enzymer, särskilt tymidylatsyntas och även andra folatberoende steg. 5-fluorouracil omvandlas intracellulärt till FdUMP, som tillsammans med metylen-THF bildar ett stabilt kovalent komplex med tymidylatsyntas och ger funktionell tymidinbrist.

Hydroxiurea inaktiverar den radikal som krävs för RNR:s katalys. Teriflunomid, den aktiva metaboliten av leflunomid, hämmar mitokondriellt DHODH och begränsar pyrimidintillgången i aktiverade lymfocyter. Mykofenolat hämmar IMP-dehydrogenas och minskar GMP/GTP, vilket ger relativ selektivitet för lymfocyter med stort beroende av de novo-guanylatproduktion.

Azatioprin omvandlas till 6-merkaptopurin och vidare genom HGPRT till tio-IMP. Metaboliterna hämmar flera purinsyntessteg och kan omvandlas till tioguaninnukleotider som inkorporeras i DNA och RNA. Benmärgshämning, mukosit, infektioner och levertoxicitet är kliniskt centrala risker. Allopurinol och febuxostat hämmar xantinoxidas och minskar nedbrytningen av tiopuriner; kombination utan kraftig dosreduktion och monitorering kan orsaka livshotande myelosuppression. Resistens kan uppstå genom ändrad transport, minskad läkemedelsaktivering, ökat målprotein eller förändrad enzymaktivitet.

Biokemisk diagnostik, flödesmätning och felkällor

Serum- eller plasmaurat används vid utredning och behandling av hyperurikemi, men visar inte ensamt om orsaken är överproduktion eller nedsatt utsöndring. Orotat, 2,8-dihydroxiadenin och bredare purin- och pyrimidinprofiler analyseras vanligen i urin eller plasma med LC-MS/MS. Metabolitprofilen kan kompletteras med enzymaktivitetsmätning i erytrocyter, leukocyter eller odlade fibroblaster samt genetisk diagnostik.

Isotopspårning används för att mäta metaboliskt flöde snarare än endast poolstorlek. ^13C-glycin kan följas in i purinringen, ^13C-glukos visar bidrag från pentosfosfatväg och centrala kolflöden, och ^15N-glutamin kan påvisa amidkvävets införlivande i puriner och pyrimidiner. Isotopmönstret kan därmed skilja ökad de novo-syntes från salvage av omärkta baser eller nukleosider.

Nukleotider omsätts snabbt efter provtagning. Fördröjd nedkylning eller separation, hemolys och otillräcklig metabolitstoppning kan därför kraftigt förändra ATP-, ADP- och dNTP-nivåer. Tolkningen påverkas dessutom av kost, fasta, alkoholintag, njurfunktion, cytostatika, immunosuppressiva läkemedel och transfusioner. Vid cellbaserade analyser måste populationens sammansättning och proliferationsgrad beaktas: vilande lymfocyter, aktiverade lymfocyter, benmärgsceller och tumörceller har mycket olika nukleotidflöden.

Källor

• Purine
• Puriner
• Category:Purine
• Purine
• Bild: File:5 purin és pirimidin.JPG — Borkarebeka/www.esalq.usp.br, Public domain
• Bild: File:7 purin bioszintézis.JPG — Borkarebeka/www.esalq.usp.br, Public domain