Histokompatibilitet och HLA-matchning

Histokompatibilitet bestäms främst av HLA-systemets extrema polymorfism och av mottagarens cellulära och humorala alloimmunitet mot donatorn. Klinisk matchning kräver en samlad bedömning av HLA-typ, mismatchnivå, donatorspecifika antikroppar och crossmatch, med olika krav vid transplantation av solida organ respektive hematopoetiska stamceller. En hög grad av allelidentitet minskar i regel immunologisk risk men eliminerar den inte.

Begrepp och klinisk avgränsning

Histokompatibilitet är graden av immunologisk förenlighet mellan vävnad från en donator och immunsystemet hos en mottagare. Begreppet omfattar både mottagarens reaktion mot transplantatet och, vid allogen hematopoetisk stamcellstransplantation, transplantatets immuncellers reaktion mot mottagaren. HLA-systemet, den humana motsvarigheten till major histocompatibility complex, MHC, utgör den viktigaste genetiska barriären eftersom HLA-molekyler både är starkt polymorfa alloantigen och presenterar andra polymorfa peptider för T-celler.

Transplantationer klassificeras efter den genetiska relationen mellan cellkälla och mottagare:

HLA-matchning är central men utgör inte hela kompatibilitetsbedömningen. ABO-antigen på endotel kan utlösa omedelbar antikroppsmedierad skada, och preformerade donatorspecifika HLA-antikroppar kan medföra hög risk även mot en i övrigt välmatchad donator. Minor histokompatibilitetsantigen, endotelantigen och andra icke-HLA-antigen kan också driva alloimmunitet. Den kliniska betydelsen modifieras dessutom av organets immunogenicitet, ischemi–reperfusionsskada, immunsuppression, infektioner och tidigare sensibilisering.

HLA-regionens genetiska organisation och nedärvning

HLA-komplexet ligger på kromosom 6:s korta arm, 6p21.3, och omfattar cirka 4 Mb. Regionen innehåller ett stort antal tätt kopplade immunologiska gener. De klassiska klass I-generna är HLA-A, HLA-B och HLA-C, medan klass II-regionen omfattar HLA-DR, HLA-DQ och HLA-DP. Mellan dessa finns klass III-regionen med bland annat gener för komplementfaktorerna C2 och C4, faktor B och tumörnekrosfaktor, TNF.

En HLA-haplotyp är den uppsättning HLA-alleler som finns på en enskild kromosom 6 och normalt nedärvs som en enhet. Varje individ får en haplotyp från vardera föräldern, och allelerna uttrycks kodominant. En heterozygot individ kan därför uttrycka två olika produkter vid vart och ett av HLA-A-, HLA-B- och HLA-C-loci samt flera klass II-heterodimerer.

HLA-regionens täta koppling medför uttalad kopplingsobalans: vissa allelkombinationer förekommer tillsammans oftare än vad oberoende nedärvning skulle ge. Rekombination förekommer men är relativt ovanlig inom ett enskilt familjematerial. För helsyskon är sannolikheten därför ungefär 25 % att de har ärvt samma två föräldrahaplotyper, 50 % att de delar en haplotyp och 25 % att de inte delar någon föräldrahaplotyp. Rekombination kan ge avvikelser från denna förenklade 25–50–25-fördelning och måste övervägas när familjetypningen förefaller inkonsekvent.

HLA-molekylernas struktur, uttryck och fysiologiska funktion

Klass I-molekyler består av en polymorf, membranbunden α-kedja med domänerna α1, α2 och α3 samt den icke-polymorfa lätta kedjan β2-mikroglobulin. Peptidbindningsfåran bildas av α1- och α2-domänerna och är sluten i ändarna. α3-domänen interagerar med CD8. HLA klass I uttrycks på nästan alla kärnförande celler och även på trombocyter, medan erytrocyter saknar klassiskt HLA-uttryck.

Klass II-molekyler är membranbundna α/β-heterodimerer. Båda kedjorna bidrar till peptidbindningsfåran, som är öppen i ändarna. HLA-DR:s polymorfism är huvudsakligen koncentrerad till β-kedjan, medan både α- och β-kedjor kan bidra till variationen hos DQ och DP. Konstitutivt uttryck finns främst på dendritiska celler, B-celler och monocyter/makrofager. Interferon-γ kan inducera klass II-uttryck på bland annat endotel- och epitelceller, vilket ökar deras förmåga att delta i lokal alloimmunitet.

De icke-klassiska klass I-molekylerna HLA-E, HLA-F och HLA-G är mindre polymorfa och har mer specialiserade regulatoriska funktioner. HLA-E presenterar bland annat signalpeptider från andra klass I-molekyler och interagerar med CD94/NKG2-receptorer på NK-celler. HLA-G bidrar till immunologisk tolerans, särskilt vid gränsytan mellan placenta och maternell vävnad. Klass III-gener benämns av historiska och genetiska skäl som en del av MHC men kodar inte antigenpresenterande HLA-molekyler.

Antigenprocessning och peptidpresentation

I klass I-vägen bryts cytosoliska proteiner ned av proteasomen. Peptidfragment transporteras därefter genom membranet till endoplasmatiskt retikel via TAP1/TAP2. Den nybildade klass I-tunga kedjan stabiliseras initialt av chaperoner och associerar med β2-mikroglobulin. I peptidladdningskomplexet, där bland annat tapasin medverkar, selekteras peptider med tillräcklig bindningsstabilitet. Det färdiga HLA–peptidkomplexet transporteras via Golgiapparaten till cellytan.

Klass I presenterar vanligen peptider som är 8–10 aminosyror långa för CD8-positiva T-celler. Peptiden förankras i specifika fickor i bindningsfåran, och både HLA-molekylens yta och exponerade peptidrester kontaktas av T-cellsreceptorn. Dendritiska celler kan även föra extracellulärt material till klass I-vägen, så kallad korspresentation. Detta möjliggör priming av cytotoxiska T-celler mot virus- eller tumörantigen som den dendritiska cellen inte själv producerar.

I klass II-vägen tas antigen upp genom endocytos, fagocytos eller receptormedierat upptag och proteolyseras i surgjorda endosomala och lysosomala kompartment. Klass II-molekylen syntetiseras i endoplasmatiskt retikel tillsammans med invariant chain, CD74, som blockerar bindningsfåran och styr komplexet till ett MHC class II compartment, MIIC. CD74 bryts ned tills CLIP-fragmentet återstår. HLA-DM underlättar utbyte av CLIP mot en antigen peptid och selekterar stabila komplex.

Klass II-fåran är öppen och binder vanligen 13–25 aminosyror långa peptider, med en central bindande kärna och utskjutande flanker. Polymorfier i klass I- och klass II-molekylernas bindningsfåror förändrar vilka peptider som kan bindas, komplexens stabilitet och vilka ytor som exponeras för T-cellsreceptorer och antikroppar. Därmed påverkar samma HLA-polymorfism både normal infektionsimmunitet och transplantationsrelaterad alloreaktivitet.

Alloigenkänning och den cellulära grunden för HLA-barriären

Vid direkt alloigenkänning binder mottagarens T-cellsreceptorer till intakta donator-HLA–peptidkomplex på donatorns antigenpresenterande celler. Donatorns dendritiska celler kan migrera från transplantatet till mottagarens lymfoida organ och aktivera både CD8- och CD4-positiva T-celler. Direkt igenkänning dominerar ofta tidigt efter transplantation, medan transplantatet fortfarande innehåller många funktionella donator-APC.

Alloreaktiviteten är ovanligt stark: ungefär 1–10 % av T-cellsrepertoaren kan reagera mot ett givet främmande HLA. Detta beror inte på att T-celler är utvecklade specifikt för alloantigen, utan på korsreaktivitet mellan främmande HLA–peptidkomplex och de strukturer som T-cellsreceptorer selekterats att känna igen. Aktiveringen ger cytokiner, cytotoxisk effektorfunktion, makrofagrekrytering och inflammation i transplantatets mikrocirkulation och parenkym.

Vid indirekt alloigenkänning tar mottagarens APC upp donatorproteiner, inklusive donator-HLA, bryter ned dem och presenterar peptiderna på mottagarens egna HLA-molekyler. Denna väg kan kvarstå så länge transplantatet avger antigen och är viktig för CD4-medierad T–B-cellssamverkan, DSA-bildning och kronisk graftskada. Vid semidirekt alloigenkänning förvärvar mottagarens APC intakta donator-HLA-komplex, exempelvis genom extracellulära vesiklar, och visar dem tillsammans med egna processade donatorpeptider.

Minor histokompatibilitetsantigen och andra icke-HLA-barriärer

Minor histokompatibilitetsantigen uppstår när polymorfa proteiner kodade utanför HLA-regionen processas till peptider som skiljer sig mellan donator och mottagare. Peptiderna presenteras av HLA på vanligt sätt. En T-cell kan därför reagera mot en donatorpeptid trots att själva HLA-molekylen är identisk hos båda individerna. Full HLA-matchning innebär således inte fullständig genetisk eller immunologisk identitet.

H-Y-antigen är peptider från Y-kromosomkodade proteiner. Vid transplantation från kvinnlig donator till manlig mottagare kan kvinnliga donator-T-celler känna igen dessa peptider som främmande, vilket är särskilt relevant vid stamcellstransplantation. HA-1 är ett annat välstuderat minor antigen. Vissa minor antigen uttrycks brett, medan andra huvudsakligen finns i hematopoetiska celler.

Vävnadsuttrycket bestämmer den kliniska konsekvensen. Ett brett uttryckt minor antigen kan bidra till graft-versus-host-sjukdom, GVHD, i hud, tarm och lever. Ett hematopoetiskt begränsat antigen kan däremot möjliggöra en mer selektiv graft-versus-leukemi-effekt genom att donatorns T-celler angriper kvarvarande maligna blodceller. Minor antigen ska skiljas från ABO-antigen, endotelantigen och andra icke-HLA-mål för antikroppar, även om samtliga kan bidra till kronisk kärlskada eller transplantatförlust.

HLA-nomenklatur, typningsnivåer och laboratoriemetoder

Ett fullständigt allelnamn kan exempelvis skrivas HLA-A*02:01:01:02N. HLA-A anger locus. Det första numeriska fältet anger allelgrupp, ofta relaterad till en serologisk antigenfamilj. Det andra skiljer proteinkodande sekvenser, det tredje anger synonym variation i kodande sekvens och det fjärde variation i icke-kodande regioner. Suffixet N betecknar en nullallel utan normalt uttryckt produkt; andra suffix kan ange lågt, osäkert, avvikande eller sekretoriskt uttryck.

Lågupplöst typning identifierar vanligen breda antigen- eller allelgrupper, medan högupplöst typning särskiljer alleler som kodar olika proteiner. Intermediär upplösning ligger mellan dessa nivåer och kan lämna en begränsad uppsättning möjliga alleler. Vilken upplösning som behövs beror på transplantationsform: organallokering kan använda annan detaljnivå än sökning efter obesläktad stamcellsdonator.

Fasning innebär att avgöra vilka sekvensvarianter som sitter på samma kromosom. Otillräcklig fasning kan ge flera möjliga allelkombinationer. Andra problem är allelbortfall när en primer inte binder till en variant, nya alleler som saknas i databasen samt null- och låguttryckta alleler som kan feltolkas om endast genotypen rapporteras. Oväntade resultat bör bekräftas med annan metod eller separat prov.

HLA-antikroppar, sensibilisering och immunologisk riskprofil

HLA-antikroppar utvecklas främst efter graviditet, transfusion eller tidigare transplantation. Exponeringen aktiverar HLA-specifika B-celler som efter T-cellshjälp kan genomgå affinitetsmognad, klassbyte och differentiering till minnes-B-celler och långlivade plasmaceller. Antikroppsnivån kan senare sjunka under detektionsgränsen men snabbt öka vid förnyad antigenexponering.

Panelreaktiva antikroppar, PRA, anger hur stor andel av en testpanel som mottagarens serum reagerar mot. Beräknat PRA, cPRA, utgår i stället från identifierade oacceptabla HLA-antigen och deras frekvens i den relevanta donatorpopulationen. Ett högt cPRA innebär att en stor andel potentiella donatorer förväntas vara inkompatibla. Donatorspecifika antikroppar, DSA, är antikroppar riktade mot HLA som den aktuella donatorn bär.

CDC-baserade antikroppsanalyser identifierar främst antikroppar som kan binda celler och aktivera komplement. Solid-phase assays, särskilt single-antigen beads, SAB, kan separat analysera reaktivitet mot ett stort antal klass I- och klass II-molekyler. Kompletterande analyser kan undersöka komplementbindning eller antikroppstiter. Sådana egenskaper kan bidra till riskbedömningen men ersätter inte den kliniska helhetsvärderingen.

Fluorescenssignalen rapporteras ofta som median fluorescence intensity, MFI. MFI är semikvantitativt och påverkas av antigenmängd på beads, antikroppsaffinitet, interferens och instrumentinställningar. Det finns ingen universell MFI-gräns som säkert skiljer kliniskt betydelsefull från betydelselös antikropp. Trender, spädningsresultat, specificitetsmönster, tidigare serum och korrelation till donatorns HLA måste vägas in.

Crossmatch: fysisk, virtuell och retrospektiv bedömning

Vid CDC-crossmatch inkuberas mottagarserum med donatorns lymfocyter och komplement. Celldöd talar för komplementaktiverande antikroppar mot antigen på donatorcellerna. Flödescytometrisk crossmatch, FCXM, mäter i stället antikroppsbindning till donatorns T- och B-celler med fluorescensmärkta sekundärantikroppar och är känsligare än CDC.

Virtuell crossmatch innebär att donatorns HLA-typ jämförs med mottagarens aktuella och historiska antikroppsprofil. Ett tillförlitligt negativt resultat förutsätter tillräckligt detaljerad och korrekt donatortypning, aktuell provtagning, validerad antikroppsanalys och kännedom om tidigare påvisade antikroppar. Metoden möjliggör snabb organallokering utan att invänta transport av donatorceller.

Ett nyligt sensibiliserande tillbud, exempelvis transfusion, graviditet eller transplantatförlust, kan göra ett äldre negativt serum otillräckligt. Historiska DSA kan vara kliniskt relevanta även om de inte längre detekteras. Fysisk crossmatch kan därför fortfarande krävas i riskfall. En retrospektiv crossmatch utförs efter beslut eller transplantation för att verifiera den immunologiska bedömningen. Resultatet måste tolkas mot laboratoriets lokalt validerade gränser.

Matchning vid transplantation av solida organ

Vid njurtransplantation har matchning traditionellt räknats vid HLA-A, HLA-B och HLA-DR. Varje locus bidrar med högst två mismatcher, vilket ger totalt 0–6 mismatcher. En 0-mismatch innebär att mottagaren inte exponeras för något nytt antigen vid dessa sex positioner. God matchning minskar i regel risken för cellulär avstötning, sensibilisering och behovet av framtida omtransplantation.

HLA-DQ har fått ökande betydelse eftersom de novo DSA efter njurtransplantation ofta är riktade mot DQ. Allel- eller antigenräkning fångar inte alltid den biologiska skillnaden mellan två molekyler. Molekylär mismatchbörda, baserad på aminosyror eller strukturella ytor, kan därför ge kompletterande information om risken för antikroppsbildning och långtidsskada. Resultatet påverkas samtidigt starkt av följsamhet, immunsuppression, inflammation och läkemedelsexponering.

Vid hjärt- och lungtransplantation begränsar kort tolererad ischemitid och mottagarens medicinska angelägenhet möjligheten att invänta optimal HLA-matchning. Där blir undvikande av relevanta DSA ofta viktigare än maximal allelidentitet. Levern är relativt motståndskraftig mot vissa humorala barriärer, men DSA och mismatch kan fortfarande vara betydelsefulla i särskilda situationer. HLA-matchning kan övervägas vid högriskkorneatransplantation, särskilt i vaskulariserade och inflammerade recipientbäddar.

Donatorval vid allogen hematopoetisk stamcellstransplantation

Vid obesläktad stamcellsdonation eftersträvas högupplöst allelmatchning. En 8/8-match omfattar HLA-A, HLA-B, HLA-C och HLA-DRB1, med två alleler per locus. När HLA-DQB1 inkluderas används beteckningen 10/10. HLA-DPB1 bedöms ofta separat eftersom full DPB1-identitet är mindre vanlig och vissa mismatchningar är kliniskt mer acceptabla än andra.

DPB1-mismatch kan klassificeras med modeller för T-cellsepitopgrupper. En permissiv mismatch förväntas ge lägre alloreaktivitet än en icke-permissiv mismatch, men bedömningen är probabilistisk och måste kombineras med övriga donatorfaktorer. Mottagarens DSA mot donatorns HLA är särskilt viktiga eftersom de kan angripa de infunderade stamcellerna och öka risken för utebliven engraftment eller graft failure.

När flera donatorer är möjliga vägs yngre donatorålder ofta tungt. Även cellkälla, donatorns och mottagarens CMV-status, donatorns kön och graviditetshistorik, ABO-förenlighet, tillgänglighet och insamlingstid beaktas. ABO-mismatch är inte samma barriär som HLA-mismatch och kan ofta hanteras, men kan medföra hemolys, erytrocytaplasi eller fördröjd erytroid återhämtning.

Kliniska konsekvenser: avstötning, engraftment och graft-versus-host-sjukdom

Hyperakut avstötning uppträder inom minuter till timmar och orsakas av preformerade antikroppar mot donatorns ABO- eller HLA-antigen. Antikroppsbindning till endotel aktiverar komplement, trombocyter och koagulation. Följden blir mikrovaskulär trombos, ischemi, blödning och snabb transplantatnekros. Tillståndet är ovanligt efter korrekt antikroppsscreening och crossmatch men är vanligen irreversibelt när det väl har utvecklats.

Akut avstötning kan uppträda från dagar till månader eller senare vid otillräcklig immunsuppression. T-cellsmedierad avstötning ger interstitiell inflammation, endotelskada och parenkymskada. Antikroppsmedierad avstötning förutsätter vanligen morfologiska tecken på mikrocirkulationsskada tillsammans med serologiska och ibland komplementrelaterade fynd. Behandlingen riktas efter mekanism och kan omfatta kortikosteroider, T-cellsdepleterande behandling, plasmautbyte, intravenöst immunglobulin och B-cells- eller plasmacellsinriktade strategier.

Kronisk graftskada utvecklas över månader till år genom upprepad eller låggradig alloimmunitet i kombination med icke-immunologiska skador. Typiska slutstadier är transplantatvaskulopati, kärlintimaförtjockning, parenkymal atrofi och interstitiell fibros. De novo DSA, särskilt kvarstående klass II-DSA, är associerade med kronisk antikroppsmedierad skada och transplantatförlust.

Vid stamcellstransplantation är graft failure utebliven eller förlorad hematopoetisk engraftment. Riskfaktorer omfattar HLA-mismatch, DSA, otillräckligt cellantal, infektion och otillräcklig konditionering. Akut GVHD drabbar framför allt hud, gastrointestinalkanal och lever, medan kronisk GVHD kan ge multiorgan inflammation och fibros. HLA- och minor-antigenmismatch driver donator-T-cellernas igenkänning av mottagaren.

Samma alloreaktivitet kan vara terapeutiskt värdefull. Graft-versus-leukemi-effekten innebär att donatorns immunceller eliminerar kvarvarande maligna hematopoetiska celler och minskar återfallsrisken. Målet är därför inte fullständig immunologisk passivitet utan en balans mellan antitumoral effekt, engraftment, GVHD och infektionsrisk under immunrekonstitutionen.

Matchning bortom allelidentitet

Mismatch kan beskrivas på flera biologiska nivåer. En antigenmismatch avser bred serologisk skillnad, medan allelmismatch identifieras med DNA-typning. Aminosyramismatch beskriver enskilda sekvensskillnader. En epitop är en struktur som faktiskt känns igen av en B- eller T-cellsreceptor, medan ett eplet är en beräknad liten konfiguration av ytligt belägna aminosyror som antas kunna ingå i en antikroppsepitop.

Algoritmer som HLAMatchmaker jämför donatorns och mottagarens HLA-strukturer och uppskattar antalet främmande eplet. En hög strukturell mismatchbörda kan innebära fler möjliga mål för antikroppsbildning och har särskilt studerats som riskmarkör för de novo DSA efter njurtransplantation. Modellerna kan också användas för att välja mellan flera donatorer som ser likvärdiga ut med konventionell antigenräkning.

Permissiv mismatch betyder att en viss skillnad bedöms vara mindre immunogen eller kliniskt mer acceptabel än en icke-permissiv skillnad. Bedömningen kan påverkas av allelspecifikt uttryck. Högre uttryck av en mismatched HLA-C- eller HLA-DP-produkt kan ge större antigenexponering än lågt uttryck. Uttrycket påverkas bland annat av regulatoriska varianter och haplotyp.

Epletmodeller är inte liktydiga med experimentellt validerade B-cellsepitoper, och en aminosyreskillnad innebär inte automatiskt att en antikropp kan bildas. T-cellsepitoper beror dessutom på antigenprocessning, peptidbindning och mottagarens HLA-repertoar. Molekylär mismatch bör därför användas tillsammans med DSA, crossmatch, organ, immunsuppression och kliniskt förlopp, inte som en fristående beslutsregel.

Felkällor, kvalitetssäkring och klinisk rapportering

Preanalytiska fel omfattar provförväxling, felaktig identitetskontroll, kontamination och låg DNA-kvalitet. Analytiska fel kan uppkomma genom allelbortfall, otillräcklig täckning, felaktig sekvensfasning eller bioinformatisk sammanblandning av närbesläktade gener och pseudogener. Skillnader mellan versioner av HLA-databasen kan ändra nomenklatur eller vilka allelalternativ som är möjliga.

Efter allogen stamcellstransplantation kan blodets leukocyt-DNA huvudsakligen komma från donatorn. Blodprov kan då ge donatorns HLA-typ i stället för mottagarens konstitutionella typ. Alternativa prov kan behövas, exempelvis dokumenterat pretransplantationsprov eller icke-hematopoetisk vävnad. Donatorns och mottagarens typning bör bekräftas på separata, korrekt identifierade prover inför transplantation.

Antikroppsanalyser påverkas av flera interferenser. Vid prozoneffekt ger hög antikroppskoncentration eller komplementinterferens paradoxalt låg signal; spädning eller laboratoriebehandling av serum kan avslöja reaktiviteten. Denaturerade HLA-molekyler på beads kan exponera kryptiska strukturer utan motsvarighet på levande celler. Ospecifik bindning, intravenöst immunglobulin och vissa monoklonala antikroppar kan ge svårtolkade signaler.

Kvalitetssäkring kräver interna kontroller, externa jämförelseprogram, dokumenterad metodvalidering och spårbarhet från provtagning till svar. Oväntade alleler, homozygoti vid flera loci eller konflikt mellan serologi och genotyp bör utredas. Antikroppsresultat måste jämföras med positiva och negativa kontroller, historiska sera, spädningsserier och vid behov fysisk crossmatch.

En klinisk rapport bör integrera:

• typade loci och metodens upplösning,
• identifierade eller kvarstående allelambiguiteter,
• antal och typ av mismatchar,
• aktuell och historisk DSA,
• fysisk eller virtuell crossmatch,
• antikroppsstyrka som semikvantitativt resultat,
• relevanta interferenser och osäkerheter,
• laboratoriets lokalt validerade beslutsgränser,
• en sammanvägd immunologisk riskbedömning.

Populationsspecifika allel- och haplotypfrekvenser påverkar sannolikheten att finna en välmatchad donator. Patienter vars haplotyper är underrepresenterade i registren kan ha betydligt sämre tillgång till matchade obesläktade donatorer. Haplotypebaserade sökalgoritmer, bredare internationella register och alternativa donatorkällor är därför både laboratoriemedicinska och jämlikhetsrelaterade komponenter i modern transplantationsverksamhet.

Källor

• Histocompatibility
• Histocompatibility
• Bild: File:MHC Classes.png — סתו כסלו, CC BY-SA 4.0
• Bild: File:MHC Endogenous and Exogenous Pathways.png — סתו כסלו, CC BY-SA 4.0